豨薟草提取物對(duì)腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

吳慧玲,吳青青,陳景泉,周彬彬,余正雙,楊澤霖,賴文芳,洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

腦卒中是嚴(yán)重危害健康的重大慢性疾病,分為缺血性和出血性腦卒中,其中缺血性腦卒中占87%[1],是目前研究腦卒中的主要焦點(diǎn)。組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是一種溶栓藥物,也是唯一獲得FDA批準(zhǔn)的治療缺血性腦卒中的藥物,但tPA治療時(shí)間窗窄,超過4.5h后用藥容易產(chǎn)生出血等不良反應(yīng)。大量腦卒中候選藥物在臨床試驗(yàn)階段以失敗告終,其主要原因是藥物作用機(jī)制單一(主要為神經(jīng)保護(hù))。研究普遍認(rèn)為,基于神經(jīng)保護(hù)與抗炎等多重藥理作用的策略進(jìn)行腦卒中藥物研發(fā),可提高研發(fā)成功的機(jī)會(huì)[2]。傳統(tǒng)中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同調(diào)控作用,研究傳統(tǒng)中藥對(duì)腦卒中的作用,對(duì)從傳統(tǒng)中藥寶庫挖掘腦卒中藥物具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

豨薟草為我國傳統(tǒng)中草藥,味苦性辛寒,歸于肝腎經(jīng)。《中國藥典》2020版記載,豨薟草的功能主治為“風(fēng)濕痹痛,筋骨無力,腰膝酸軟,半身不遂”。豨薟草在古代炮制,從事炮制中醫(yī)均言要“九蒸九曬”,以治中風(fēng),“蜜酒九蒸九曬”治四肢麻痹,腰膝無力[3]。近年來,國內(nèi)外學(xué)者越來越重視對(duì)豨薟草的研究,現(xiàn)代藥理學(xué)證明,豨薟草對(duì)腦卒中、慢性疼痛、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等疾病具有良好的治療作用[4]。本文主要研究豨薟草提取物對(duì)MCAO大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司購入60只SPF級(jí)體質(zhì)量(250～280)g的♂性SD大鼠(合格證號(hào)為2015000510392,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002)。大鼠在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按SPF級(jí)別飼養(yǎng),在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始前需對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,可自由飲水與進(jìn)食(動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(閩)2014-0005)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑豨薟草(安國潤德藥業(yè)有限公司,C21103106),經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室鑒定;NeuN抗體(ab177487),Cox IV抗體(ab202554)均購于Abcam;Bax抗體(#2772),Bcl-2抗體((#3498)均購于Cell Signaling Technology;β-actin抗體(Beyotime,AF0003);Tunel染色試劑盒(Promega,G3250);尼氏染色液(Leagene,DK0022)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器YB-6LF型石蠟包埋機(jī)、HM325型石蠟切片機(jī)(美國Thermo Fisher公司);Mini PROTEAT Tetra型垂直電泳槽、Mini TransBlot型轉(zhuǎn)印槽、ChemiDocXRS+型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);LSM 880型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。

2 方法

2.1 MCAO模型制備和分組MCAO模型的制備參照課題組前期研究[5],采用線栓法造模,假手術(shù)組除不插入線栓外其余操作同模型組。Zea-Longa評(píng)分≥2為成模。成模大鼠隨機(jī)分為模型(MCAO)組,豨薟草低、中、高劑量(即XXC-L、XXC-M、XXC-H)組,另設(shè)假手術(shù)(Sham)組,共5組,于MCAO造模2 h后灌胃。

2.2 給藥治療將豨薟草藥材烘干,粉碎,8倍量70%乙醇浸泡2 h,加熱回流提取3次,過濾,減壓濃縮,得豨薟草提取物浸膏(1 g相當(dāng)于12 g生藥量)[6]。實(shí)驗(yàn)前用0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液分別配制成濃度為0.025 kg·L-1、0.25 kg·L-1、2.5 kg·L-1的溶液。豨薟草給藥劑量參照臨床每日劑量12 g,以人60 kg體質(zhì)量換算成大鼠每日劑量為1.82 g·kg-1,豨薟草低、中、高劑量組分別以0.1、1、10倍臨床等效劑量給藥,即0.182 g·kg-1、1.82 g·kg-1、18.2 g·kg-1;假手術(shù)組和模型組灌服等體積生理鹽水,連續(xù)灌胃7天。

2.3 動(dòng)物取材與前處理大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動(dòng)脈采血。每組6只動(dòng)物斷頭取腦,分離左右腦,迅速放入液氮中保存,將缺血側(cè)左腦腦組織研磨成粉末,分裝備用;每組6只動(dòng)物心尖剪口,依次滴注生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行固定,取腦后,于4%多聚甲醛中固定24 h,使用腦模具和切片將腦組織均勻分為6片,置于70%乙醇浸泡保存,進(jìn)行組織脫水、包埋及切片。

2.4 改良神經(jīng)功能損傷(mNSS)評(píng)分各組大鼠分別在1,3,7天采用mNSS法對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡等方面綜合評(píng)估,1～6分輕度損傷,7～12分中度損傷,13～18分重度損傷[7]。

2.5 核磁共振成像(MRI)檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦梗死體積各組大鼠在第7天使用異氟烷麻醉后,至掃描床上仰臥位固定,安裝頭部線圈。7.0T小動(dòng)物核磁共振成像儀對(duì)大鼠腦部冠狀定位掃描,設(shè)置T2W1增強(qiáng)系列[8],ImageJ軟件計(jì)算大鼠缺血側(cè)腦梗死體積。

2.6 Western blot檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦組織Bax、Bcl-2、NeuN蛋白表達(dá)冰盒上提取各組大鼠腦組織總蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)膜,封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜,TBS清洗,二抗孵育1.5 h,ECL發(fā)光液顯色,凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè),分析灰度值,以目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)量。

2.7 Nissl染色法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦組織Nissl陽性細(xì)胞數(shù)腦切片脫蠟復(fù)水后于恒溫箱56 ℃焦油紫染色30 min,酒精燈加熱至冒泡,去離子水洗滌,尼氏分化液分化,無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察神經(jīng)元的情況。

2.8 免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦組織Tunel陽性細(xì)胞數(shù)及NeuN的表達(dá)腦切片脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù),蛋白酶Κ工作液孵育20 min,PBS清洗,1×平衡液室溫平衡20 min,TdT酶反應(yīng)液室溫避光孵育1 h,PBS清洗,DAPI染色4 min,PBS清洗,抗淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察、攝取圖像。陽性細(xì)胞百分比/%=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞×100%。

經(jīng)過脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)的腦切片用5%BSA室溫封閉2 h,PBS清洗,NeuN一抗4 ℃孵育過夜,次日室溫放置40 min,PBS清洗,濕盒孵育熒光二抗2 h(之后均需在避光條件下操作),PBS清洗,DAPI染色4 min,PBS清洗,抗淬滅劑封片,在鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察、拍照,Zen Light軟件進(jìn)行分析。

2.9 RT-qPCR檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦組織mRNA表達(dá)采用TRIzol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算2-ΔΔCt值。所用引物參照GenBank中大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6引物序列,由上海尚亞生物技術(shù)公司提供,詳細(xì)信息見Tab 1。

3 結(jié)果

3.1 豨薟草提取物降低MCAO大鼠mNSS評(píng)分

mNSS評(píng)分結(jié)果表明,第1 天,MCAO組大鼠評(píng)分顯著高于Sham組(P<0.01),提示MCAO模型成功;第3 天,XXC-H組評(píng)分低于MCAO組(P<0.05);第7 天,XXC-M和XXC-H組評(píng)分顯著低于MCAO組(P<0.01),提示豨薟草提取物能改善MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷(Fig 1)。

Tab 1 Sequence of primers

3.2 豨薟草提取物降低MCAO大鼠缺血側(cè)腦梗死體積經(jīng)干預(yù)7天后,MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織梗死體積高于Sham組(P<0.01),XXC-M和XXC-H組能顯著降低缺血側(cè)腦梗死體積(P<0.01),作用優(yōu)于XXC-L組,且XXC-M和XXC-H組間無明顯區(qū)別,因此選擇XXC-M組作為后續(xù)研究的劑量(Fig 2)。

3.3 豨薟草提取物促進(jìn)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織Nissl陽性細(xì)胞數(shù)經(jīng)干預(yù)7 天后,Sham組大鼠腦組織神經(jīng)元的尼氏小體表達(dá)較多且細(xì)胞形態(tài)正常;MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元的核出現(xiàn)皺縮,尼氏小體表達(dá)降低(P<0.01);XXC-M組大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元形態(tài)以及尼氏小體數(shù)量均有顯著恢復(fù)(P<0.01),提示豨薟草提取物能促進(jìn)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織中神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量(Fig 3)。

Fig 1 Effect of Herba siegesbeckiae extract on

3.4 豨薟草提取物抑制MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡經(jīng)干預(yù)7天后,MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)細(xì)胞凋亡(Tunel)數(shù)目高于Sham組(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組能明顯減少皮質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)目(P<0.01)(Fig 4a)。同時(shí),MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織Bax增加、Bcl-2降低(P<0.05,P<0.01);XXC-M組能明顯逆轉(zhuǎn)Bax和Bcl-2表達(dá)(P<0.01)(Fig 4b),提示豨薟草提取物能抑制MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

Fig 2 Effect of Herba siegesbeckiae extract on volume of ischemic cerebral infarction in MCAO

Fig 3 Effect of Herba siegesbeckiae extract on number of Nissl positive cells in ischemic brain tissue of MCAO

3.5 豨薟草提取物促進(jìn)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元核抗原NeuN表達(dá)經(jīng)干預(yù)7天后,Sham組大鼠腦組織皮層NeuN陽性細(xì)胞較多;MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN陽性細(xì)胞顯著減少(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組NeuN陽性細(xì)胞顯著增加(P<0.01)(Fig 5a)。同時(shí),MCAO組大鼠缺血側(cè)NeuN蛋白顯著低于Sham組(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組NeuN蛋白顯著升高(P<0.01)(Fig 5b),提示豨薟草提取物能改善MCAO大鼠神經(jīng)元損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

Fig 4 Effect of Herba siegesbeckiae extract on neuronal apoptosis in ischemic brain tissue of MCAO

Fig 5 Effect of Herba siegesbeckiae extract on expression of NeuN in ischemic brain tissue of MCAO

3.6 豨薟草提取物抑制MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織炎癥因子表達(dá)經(jīng)干預(yù)7天后,MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著高于Sham組(P<0.01);與MCAO組比較,XXC-M組能降低以上mRNA表達(dá)(P<0.01),提示豨薟草提取物能抑制MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織炎癥因子表達(dá)(Fig 6)。

Fig 6 Effect of Herba siegesbeckiae extract on expression of IL-1β,TNF-α and IL-6 mRNA in ischemic brain tissue

4 討論

缺血性中風(fēng)是一種復(fù)雜的腦部疾病,可通過破壞大腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。MCAO模型是最接近模擬人類缺血性中風(fēng)的模型之一,因此本研究采用該模型來探討豨薟草提取物對(duì)MCAO大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。在實(shí)驗(yàn)過程中,首先采用mNSS評(píng)估神經(jīng)功能損傷程度,MRI測(cè)腦梗死體積,研究結(jié)果表明,豨薟草提取物干預(yù)7天,顯著改善MCAO大鼠mNSS評(píng)分,降低梗死灶。同時(shí)觀察到中劑量組與高劑量組在藥效上沒有明顯差異,因此選擇中劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

腦缺血后,神經(jīng)元的存活在功能恢復(fù)中起著重要作用,NeuN是成熟神經(jīng)元標(biāo)記物,常被用于直接評(píng)估神經(jīng)元的死亡或丟失以及成為定量治療效果的可靠標(biāo)志物[9]。通過免疫熒光和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN表達(dá)受抑制,經(jīng)豨薟草提取物干預(yù)7天后,能夠改善MCAO大鼠NeuN表達(dá),表明豨薟草提取物可以減輕MCAO大鼠的神經(jīng)元損傷。為進(jìn)一步探討豨薟草提取物發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制,我們檢測(cè)了MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織Bcl-2和Bax的表達(dá)情況。細(xì)胞凋亡是腦缺血神經(jīng)元損傷過程的關(guān)鍵細(xì)胞事件,其中Bcl-2家族的抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax是細(xì)胞凋亡途徑的重要信號(hào)分子,通過調(diào)控線粒體功能障礙調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[10]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)豨薟草提取物干預(yù)7天后,大鼠缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)目減少,結(jié)合Western blot結(jié)果,豨薟草提取物能抑制Bax,促進(jìn)Bcl-2,表明豨薟草提取物對(duì)腦缺血/再灌注后誘發(fā)的缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。腦內(nèi)炎癥是腦缺血后繼發(fā)性損傷機(jī)制之一,炎癥反應(yīng)在腦卒中急性期加快缺血性損傷的形成并影響神經(jīng)元死亡和神經(jīng)組織再生[11]。本研究發(fā)現(xiàn)豨薟草提取物能顯著降低MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá),提示豨薟草提取物能抑制MCAO炎癥因子釋放,改善缺血性腦損傷。

綜上所述,豨薟草提取物能降低MCAO大鼠腦梗死體積,改善神經(jīng)功能損傷,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng),對(duì)MCAO大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。