LncRNA p21調控Hippo-YAP信號通路對小鼠腹主動脈瘤形成的影響及機制

陳 嘯,王晉軍,張林林,郭蓮蓮,張中旺,張娟子

(青島大學附屬青島市海慈醫院血管外科, 山東 青島 266023)

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一種常見的主動脈退行性疾病[1],伴隨人口老齡化以及新技術的快速發展,目前我國AAA發病率和檢出率呈逐年上升趨勢。既往研究已證實,AAA是一種慢性血管并發癥,其機制與血管壁炎癥反應、細胞外基質降解以及平滑肌細胞消耗等病理過程密切相關[2]。平滑肌細胞作為血管壁的重要組成部分,凋亡和增殖抑制是AAA疾病發生發展的關鍵因素[3]。因此,通過調控平滑肌細胞功能可能是治療AAA的關鍵所在。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一種長度大于200 nt的非編碼RNA,具有位置的表達特異性,從而參與特定組織/細胞功能調節[4]。新近研究發現,LncRNA同樣參與AAA疾病的發生發展。研究表明[5],LncRNA p21能夠通過促進血管平滑肌細胞衰老,從而加重AAA形成。另外,亦有研究證實,LncRNA p21能夠通過促進血管平滑肌細胞合成以及炎癥反應,從而介導AAA形成[6]。以上研究表明,LncRNA p21可能是臨床治療AAA的潛在新靶點。但是目前有關LncRNA p21是用過何種分子機制介導血管平滑肌細胞功能變化,特別是平滑肌細胞凋亡和增殖過程,從而促進AAA形成機制尚不清楚。為此,本研究擬通過構建血管緊張素Ⅱ(angiotensin II,AngⅡ)誘導小鼠AAA模型,探究LncRNA p21對AAA小鼠血管平滑肌細胞凋亡和增殖的影響及其調控機制,以期為AAA的臨床治療提供新的靶點和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SPF級,雄性,C57BL/6 載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠40只,體質量100～120 g,購自北京維通利華實驗動物技術公司,生產許可證:SCXK(京)2018-0017。動物適應性喂養1周,期間自由飲水,晝夜交替光照,溫度維持在20～25 ℃,相對濕度60%～70%。動物實驗符合3R原則,且通過我院動物醫學倫理委員會審查批準(SYL-2021-10-003)。

1.1.2主要試劑 Ang Ⅱ(華北制藥廠,批號:S10950163);二辛可酸(bicinchonininc acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin staining,HE)染色試劑盒、原位末端標記(TUNEL)染色檢測試劑盒、顯影液、β-actin抗體(上海碧云天生物技術公司,批號分別:P0012S、ST023、C0105S、C1091、AF5001、P0019);免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司,批號:SP-9001);基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)抗體、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)抗體、組織金屬蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1 ,TIMP-1)抗體、YAP抗體(美國Cell Signaling Technology公司,批號:40994、13667、8946、14074、72804);TRIzol裂解液(美國Invitrogen公司,批號:AM7001);RNA提取試劑盒(廣州銳博生物公司,批號:C11027-2);

1.1.3主要儀器 AngⅡ痕量緩釋泵(美國Corning公司,型號:34DB);多功能酶標儀(長春樂鏷科技有限公司,型號:LP-5117);熒光倒置顯微鏡(日本Olympus,型號:CKX53);高速冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司,型號:H3-18KR);凝膠成像系統(美國Bio-Rad伯樂公司,型號:Gel Doc XR+);qRT-PCR儀(瑞士巴塞爾羅氏診斷,型號:LightCycler480 II);-80 ℃冷凍冰箱(日本SANYO公司,型號:MDF-C8V(N))。

1.2 方法

1.2.1AAA模型構建及分組 選取40只C57BL/6 ApoE-/-小鼠隨機分為4組:假手術組(sham)、模型組(model)、LncRNA p21陰性對照組(sh-NC)、LncRNA p21敲低組(sh-LncRNA p21)。每組各10只。利用1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉小鼠。sham組小鼠皮下植入生理鹽水微量緩釋泵。model組小鼠行皮下植入AngⅡ滲透性微量泵(15 mg·kg-1·d-1),連續28 d,構建腹主動脈瘤小鼠模型[7]。Sh-NC組小鼠于造模前尾靜脈注射由廣州銳博公司合成的LncRNA p21陰性對照shRNA(50 n),并經腺病毒轉染至體內,注射后30 d進行AAA小鼠模型造模,造模方式同model組。sh-LncRNA p21組小鼠于造模前尾靜脈注射LncRNA p21(50 nmol·L-1,合成片段由上海生工生物工程股份有限公司提供)干擾shRNA,并經腺病毒轉染至體內,注射后30 d行AAA小鼠模型造模,造模方式同model組。通過提取sh-NC和sh-LncRNA p21組小鼠腹主動脈組織RNA進行PCR檢測轉染效率。

1.2.2各組小鼠相關指標檢測 各組小鼠分別飼養28 d后,斷頭法處死。打開胸腔,解剖顯微鏡下觀察腹主動脈形態變化并拍照。實驗以腹主動脈腎上段最大外側寬度大于正常組小鼠腹主動脈腎上段最大外側寬度約50%定為腹主動脈瘤。留取各組小鼠腹主動脈精準測量最大外徑,并利用ImageJ進行圖像分析,獲得各組小鼠的腹主動脈血管最大直徑。

1.2.3HE染色觀察腹主動脈血管形態變化 28 d實驗結束后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,快速打開胸腔及腹腔,暴露腹主動脈。前開左心耳,行心臟灌流,分離心臟、主動脈、腹主動脈及髂動脈、雙腎動脈。剪取合適大小腹主動脈組織(正常組織及腹主動脈瘤組織),將其采用10%多聚甲醛固定2 h、脫蠟、切片、制作厚度為3～5 μm切片,行HE染色,觀察各組小鼠血管壁以及炎癥細胞浸潤等情況。

1.2.4血管彈力纖維染色 腹主動脈切片同“1.2.3”,之后按照Verhoeff-Van Gieson(VVG)試劑盒說明進行染色。彈性蛋白降解評分:1、2、3、4級。分級越高表明彈性蛋白斷裂或丟失越嚴重,腹主動脈受損程度越高。

1.2.5TUNEL染色檢測細胞凋亡 組織片切片同“1.2.3”,與50 μL TUNEL 工作溶液在37 ℃的恒溫箱中孵育1 h。 之后,將切片用50 μL converter-POD溶液在37 ℃下保持30 min,然后用50 μL 二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)溶液在室溫下孵育10 min。 最后用蘇木精標記細胞核,隨機選取6個視野并在400×熒光顯微鏡下對凋亡細胞進行分析。

產業的發展離不開職業教育的發展。高質量的職業教育是地方經濟蓬勃發展的重要源泉，能為地方產業的創新和轉型注入活力。但是，伴隨著知識型社會對人才發展的要求不斷提升，職業教育在教育模式和專業水平等方面存在的矛盾日益突出，職業教育改革和升級迫在眉睫。

1.2.6免疫組化檢測血管組織YAP、TAZ表達 按照“1.2.3”取各組小鼠腹主動脈組織切片,經3% H2O2溶液孵育10 min,85 ℃抗原修復,加10% BSA溶液封閉20 min;加YAP和TAZ兔單克隆抗體(工作液體積稀釋比例為1 ∶200),4 ℃孵育過夜;加對應山羊抗兔二抗,室溫孵育30 min;滴加DAB顯色液,于200倍視野下隨機選取6個視野進行拍照,利用Image Pro Plus軟件進行圖像分析。通過圖像分析軟件和系統測定各組小鼠乳腹主動脈組織YAP、TAZ蛋白陽性表達面積以及積分光密度值(optical density,OD),以單位面積平均IOD(IOD/unit area)作為組織蛋白表達定量標準。

1.2.7Western blot檢測血管組織相關蛋白表達 28 d實驗結束后,立即將小鼠處死,剪取適量小鼠腹主動脈組織并提取總蛋白,按照1 ∶5質量與體積比加入裂解液,于4 ℃條件下裂解40 min;BCA法測定各組腹主動脈組織蛋白質濃度;蛋白上樣(按照每孔上樣量40 μg計算得出上樣體積);凝膠電泳;濕轉法轉膜;5% BSA室溫封閉2 h;分別加MMP-2抗體(1 ∶1 000)、MMP-9抗體(1 ∶1 000)、TIMP-1抗體(1 ∶1 000)、YAP抗體(1 ∶1 000)、TAZ抗體(1 ∶1 000)及β-actin抗體(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜;加對應的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000),室溫孵育1～2 h;TBST洗滌3次,每次5 min,滴加顯影液,顯影并拍照。

1.2.8qRT-PCR檢測腹主動脈血管組織LncRNA p21表達 使用TRIzol試劑從主動脈組織中分離、提取總RNA,然后依據制造商提取的逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。接下來,根據Light Cycler 480 Ⅱ系統上提供的方案,使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行定量qRT-PCR(擴增條件:92 ℃,30 s;92 ℃,5 s;60 ℃,31 s,循環40次)。最后使用 2-ΔΔCT方法計算法將腹主動脈組織中LncRNA p21的相對表達統一歸化為 β-actin。引物序列LncRNAp21:F-5′-CAGCCAGAAAGGACTCCAACTCC-3′;R-5′-GGAGGCAGCTGGTGCTGAAAG-3′;β-actin:F-5′-CATCGTCCACCGCAAATGCTTC-3′;R-5′-AACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3′。

2 結果

2.1 LncRNA p21在小鼠AAA中表達變化造模28 d后,與sham組相比,model組小鼠AAA發生率、主動脈直徑和主動脈質量比明顯增加(P<0.01),且腹主動脈血管壁增厚,中膜及外膜出現大量炎癥細胞浸潤,血管彈力纖維斷裂、紊亂,表明AAA小鼠模型構建成功。qRT-PCR檢測顯示,與sham組相比,model組小鼠腹主動脈血管組織LncRNA p21表達明顯升高(P<0.01),見Fig 1。

2.2 LncRNA p21對小鼠AAA形成的影響為探究LncRNA p21對小鼠AAA形成的影響,本研究通過AAA小鼠尾靜脈注射sh-LncRNA p21觀察小鼠AAA形成情況。結果顯示,與model組相比,sh-LncRNA p21組小鼠AAA發生率、主動脈直徑和主動脈質量比明顯降低(P<0.01)。HE和VVG染色顯示,與model組相比,sh-LncRNA p21組小鼠腹主動脈血管壁厚度降低、中膜層和外膜層炎癥細胞浸潤減輕,血管彈力纖維粗且斷裂減少。為進一步明確LncRNA p21對小鼠AAA小鼠形成的影響。Western blot檢測MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表達。結果顯示,與sham組相比,model組小鼠血管組織MMP-2、MMP-9表達增加,TIMP-1表達降低(P<0.01)。與model組相比,sh-LncRNA p21組小鼠血管組織MMP-2、MMP-9表達降低(P<0.01),TIMP-1表達增加(P<0.05),見Fig 2。

Fig 1 Changes in expression of LncRNA p21 in AAA n=6)

2.3 LncRNA p21對主動脈平滑肌細胞凋亡和增殖的影響與sham組相比,model組小鼠血管平滑肌細胞凋亡率、caspase-3蛋白表達明顯增加,cyclinD1表達降低(P<0.01)。與model組相比,sh-LncRNA p21組小鼠血管平滑肌細胞凋亡率、caspase-3蛋白表達明顯降低,cyclinD1表達增加(P<0.01),表明LncRNA p21能夠誘導AAA小鼠血管平滑肌細胞凋亡,抑制其增殖,見Fig 3。

Fig 2 Effect of LncRNA p21 on formation of AAA in mice n=6)

Fig 3 Effect of LncRNA p21 on apoptosis and proliferation of vascular smooth muscle cells in AAA n=6)

2.4 LncRNA p21對Hippo-YAP信號通路的影響免疫組化檢測顯示,與sham組相比,model組小鼠腹主動脈血管組織YAP、TAZ陽性表達明顯降低(P<0.01)。與model組相比,sh-LncRNA p21組小鼠腹主動脈血管組織YAP、TAZ陽性表達明顯增加(P<0.01)。Western blot檢測顯示,與sham組相比,model組小鼠腹主動脈血管組織YAP、TAZ蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與model組相比,sh-LncRNA p21組小鼠腹主動脈血管組織YAP、TAZ蛋白表達明顯增加(P<0.01),見Fig 4。

3 討論

AAA是一種常見的,具有潛在的致命性血管動脈瘤,主要與高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化等心血管高危因素密切相關。現如今學術界普遍認為AAA的發病機制較為復雜,涉及動脈血管壁炎癥反應、血管平滑肌細胞丟失、氧化應激等,從而誘發主動脈血管局部不間斷膨大,并最終導致主動脈血管壁形成不可挽救的損傷[8]。目前,臨床上有關AAA的外科手術治療以及常規藥物治療能夠改善其臨床癥狀,但是AAA破裂導致的患者因搶救無效而快速死亡的發生率一直居高不下。因此,通過明確AAA的發病機制,尋找其有效防治措施,從而在源頭上降低AAA發生率對臨床具有重大意義。

非編碼RNA一直以來是AAA疾病發生發展的研究熱點與難點。研究已證實如miRNAs能夠通過靶向相關功能蛋白,從而調節炎癥反應、凋亡以及細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解等參與AAA形成[9]。作為非編碼RNA中一種LncRNAs能夠通過影響蛋白的轉錄及翻譯等過程,參與機體眾多生理病理過程。同樣,LncRNAs亦參與了AAA的形成。新近研究顯示,LncRNA LBX2-AS1、LncRNA GAS5可以通過影響血管平滑肌炎癥和細胞凋亡過程參與AAA的形成[10-11],表明LncRNAs可能是AAA治療的潛在靶點。因此以LncRNAs為切入點進行AAA研究具有重要意義。LncRNA p21是位于人第6號染色體上不編碼蛋白質的非編碼RNA,受p53基因調控,同時又是p53信號通路轉錄抑制因子,能夠觸發細胞凋亡[12]。研究發現,LncRNA p21是一種細胞凋亡、增殖等調節因子,參與了AAA的形成[6]。為此本研究通過AngⅡ誘導ApoE-/-小鼠AAA模型,明確LncRNA p21表達。結果顯示AngⅡ誘導組小鼠腹主動脈血管壁增厚,中膜及外膜出現大量炎癥細胞浸潤,血管彈力纖維斷裂,紊亂,且主動脈直徑和主動脈質量比顯著增加,表明AAA小鼠模型構建成功。相比于正常小鼠,AAA小鼠腹主動脈組織LncRNA p21表達明顯增加,這一結果與Guo等[5]研究一致。血管平滑肌細胞是血管壁的重要組成部分,其細胞丟失、增殖抑制以及ECM降解均是AAA發生的關鍵。既往研究發現,在AAA小鼠血管組織中MMP相關蛋白表達和活性的增強以及TIMP相關蛋白表達的降低能夠促進血管平滑肌細胞凋亡和ECM降解,從而導致AAA形成[13]。因此,本研究將LncRNA p21與血管平滑肌增殖、凋亡及ECM降解的關系作為研究重點。以往研究報道在動脈粥樣硬化中LncRNA p21能夠抑制血管平滑肌細胞增殖,促進凋亡。而降低LncRNA p21能夠有效改善頸總動脈血管內膜損傷[14]。為此,本研究推測LncRNA p21可能通過調控血管平滑肌細胞增殖、凋亡和ECM,促進AAA形成。為明確LncRNA p21對AAA血管平滑肌細胞增殖、凋亡和ECM降解的作用。本研究通過AAA小鼠尾靜脈注射sh-LncRNA p21。結果顯示,與sham組小鼠相比,model組小鼠血管平滑肌細胞凋亡增加,增殖被抑制,MMP-2、MMP-9蛋白表達升高及TIMP-1蛋白表達降低,再次表明血管平滑肌細胞增殖、凋亡及ECM降解是AAA形成的關鍵。Xue等[15]研究證實,AngⅡ可以誘導小鼠型主動脈血管平滑肌細胞凋亡增加,其機制與MMP-2、MMP-9表達增加引起的ECM降解密切相關。TIMP-1作為MMPs的重要調控因子,可調節MMPs表達。與model組相比,AAA小鼠尾靜脈注射sh-LncRNA p21能夠上調MMP-2、MMP-9,下調TIMP-1,抑制ECM降解,降低血管平滑肌細胞凋亡,促進其增殖。

Fig 4 Effect of LncRNA p21 on

Hippo-YAP信號通路與細胞增殖、凋亡密切相關。YAP、TAZ作為Hippo信號通路的主要轉錄共激活因子,能夠克服細胞接觸抑制,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,從而加快惡性腫瘤的發展[16]。另外,研究發現,通過阻斷Hippo信號,能夠上調YAP、TAZ表達,促進腫瘤細胞增殖及腫瘤惡化[17]。新近研究證實,在Ang Ⅱ誘導AAA小鼠模型及AAA患者血管組織中YAP表達明顯降低,而過表達YAP能夠促進血管平滑肌細胞增殖,抑制凋亡,減弱AAA的形成[18]。本研究發現,與sham組相比,model組小鼠YAP、TAZ表達明顯降低。與model組相比,sh-LncRNA p21組小鼠YAP、TAZ表達明顯增加。

綜上所述,通過探究LncRNA p21對小鼠AAA形成的影響及其調控機制。結果發現LncRNA p21能夠促進小鼠AAA形成,其機制與調控Hippo-YAP信號,下調YAP、TAZ表達,促進細胞凋亡,抑制細胞增殖相關。以上研究結果初步揭示了LncRNA p21在AAA形成中的機制,為臨床防治AAA提供了新的潛在干預靶點。但是本研究也存在一定的局限性,未能進一步闡明LncRNA p21是如何影響Hippo-YAP信號激活。為此本研究后續將通過生物信息學方法預測LncRNA p21下游靶miRNAs,通過熒光素酶報告基因和過表達實驗明確LncRNA p21對Hippo-YAP信號轉導的直接或間接調控作用。