靶向血小板的抗腫瘤藥物研究進展

周玥珂,錢 程,唐 彧,韋忠紅,陸 茵,2,王愛云,2

(南京中醫藥大學 1.藥學院,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室、2.江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心,江蘇 南京 210023)

王愛云(1974-),女,博士,教授,研究方向:活血化瘀中藥對腫瘤轉移的影響,通信作者,E-mail:way9815@163.com

在腫瘤進展過程中,少量癌細胞從原發病灶侵入周圍組織,并進入循環系統。這些循環腫瘤細胞(CTC)與癌癥轉移或預后之間的關系已在很多類型的癌癥中確定,包括肺癌、乳腺癌、結腸癌等。CTC直接與紅細胞、血小板、巨噬細胞和許多其他免疫細胞相互作用。血小板是血栓形成的關鍵調節因子,其主要功能是在血管損傷的情況下防止出血并減少失血。與正常人相比,癌癥患者的血栓形成和血栓栓塞發生率增加了5倍以上[1]。越來越多的證據表明,血小板可以通過與癌細胞之間的多種相互作用促進腫瘤的發生和轉移。例如,癌癥通過直接誘導腫瘤-血小板聚集體、觸發血小板顆粒和細胞外囊泡釋放、改變血小板表型以及增加血小板產生來改變血小板行為。而血小板通過增殖信號,抗凋亡作用和血管生成因子來增強腫瘤生長,通過誘導腫瘤細胞的侵襲性上皮 -間充質過渡表型來激活腫瘤侵襲并維持轉移[2]。已有研究表明,腫瘤細胞能夠激活血小板,同時可以誘導血小板分泌多種物質,并且這些物質參與腫瘤的發生和發展,在腫瘤血行轉移過程中發揮著關鍵性的作用[3]。因此,癌細胞和血小板維持著復雜的雙向通訊。

多年來,抗血小板治療的抗癌潛力一直被廣泛研究。用于預防癌癥發展和轉移的靶向血小板的藥理學方法主要是一些目前用于心血管疾病的抗血小板藥物的應用以及其他新的藥理學策略。盡管在臨床前模型中,其中一些方法已經獲得了令人驚喜的結果,但除了阿司匹林,抗血小板藥物在癌癥中有益作用的臨床證據仍然在很大程度上缺失。如何使癌癥患者從抗血小板治療中獲得最大益處,仍然存在重大挑戰。

1 血小板支持腫瘤生長和轉移

1.1 血小板促進腫瘤生長,并誘導腫瘤血管生成證據表明,血小板對腫瘤細胞增殖有直接影響。血小板有著豐富的顆粒和復雜的內部膜系統,其主要功能是分泌。血小板胞質內含有3種顆粒:α顆粒、致密顆粒、溶酶體顆粒。血小板α-顆粒膜蛋白是血小板活化釋放的特異標志之一。腫瘤細胞誘導的血小板活化促進血小板α顆粒分泌轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF),這些因素不僅能誘導腫瘤生長,還能促進腫瘤新生血管[4]。

蛋白酶激活受體(PAR)是一類獨特的G蛋白偶聯跨膜受體,影響多種生化反應,如止血、血管生物學和各種炎癥表型。凝血酶是血小板PAR最有效的激活劑。人血小板表達PAR1和PAR4。PAR1是人血小板上的“高親和力”凝血酶受體[5]。除了觸發血小板聚集外,凝血酶介導的血小板PAR-1和PAR-4裂解誘導血小板PDGF、VEGF的選擇性釋放,可促進腫瘤生長[6]。

P2Y12受體是一種G蛋白偶聯受體(GPCR),二磷酸腺苷(ADP)是P2Y12受體的天然激動劑。血小板致密顆粒中儲存著大量二磷酸腺苷(ADP),在其他激動劑誘導血小板活化后,ADP被釋放,然后激動P2Y12受體,維持血小板聚集,放大血小板反應。有研究表明,血小板上的P2Y12介導血小板對卵巢癌的促生長作用,敲除P2Y12及P2Y12拮抗劑在體內和體外都能夠減少卵巢癌細胞的增殖和增加細胞凋亡[7]。

1.2 血小板促進腫瘤轉移轉移是癌癥相關死亡的主要原因,也是患者護理中的主要挑戰。盡管已經開發出許多抗癌療法,但一旦發生轉移性擴散,預后仍然較差。腫瘤轉移按順序發展:腫瘤細胞從原發腫瘤中脫離并侵入血液或淋巴循環,血流內運輸,遠端部位的外滲和定植以及繼發性腫瘤的生長。雖然一些機制反映了腫瘤細胞自主轉移過程,但大多數需要腫瘤細胞與血細胞(包括骨髓細胞和血小板)相互作用,再發生轉移[8]。腫瘤細胞通過刺激各種介質,如組織蛋白酶G或凝血酶,以及通過在血小板表面持續表達組織因子來激活血小板,被激活的血小板很快就會與癌細胞表面結合,通過復雜的信號機制傳遞給腫瘤細胞,以增加其轉移能力,有助于促進轉移環境的形成[9]。

血小板糖蛋白(GP)受體介導血小板黏附、活化和聚集。重要的血小板膜受體包括糖蛋白Ib-IX-V(GPIb-IX-V)、糖蛋白VI(GPVI)和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb-Ⅲa,也稱為整合素αⅡbβ3)。這些GP受體協調血小板-腫瘤細胞的相互作用,促進腫瘤轉移,阻斷它們可能是一種有效的抗癌策略。GPVI是一種膠原蛋白和纖維蛋白的血小板特異性受體,可通過免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)信號激活血小板,進而調控血小板黏附、聚集和促凝活性,小鼠血小板GPVI的遺傳缺陷有效地削弱了血小板-腫瘤細胞相互作用,減少了結腸癌細胞和乳腺癌細胞轉移[8]。

選擇素是參與白細胞,血小板和內皮之間相互作用的血管細胞粘附分子。P-選擇素(P-Selectin)是參與血小板和內皮細胞相互作用的血管細胞黏附分子,儲存在血小板α顆粒中,并在活化的血小板和內皮上表達。活化后,P-選擇素通過胞吐作用迅速轉移到細胞膜上[10]。與健康動物相比,患有乳腺癌的小鼠血小板上P-選擇素的表達升高,而P-選擇素表達,是乳腺癌肺轉移變異程度的重要因素之一[11]。

2 靶向血小板的抗腫瘤藥物

抑制血小板或阻斷血小板與腫瘤細胞的相互作用已成為抑制腫瘤進展的一種策略。目前已開發出許多靶向血小板受體、干擾血小板顆粒釋放或抑制血小板特異性酶的藥物。由于這些藥物對止血功能的干擾,以及當下對血小板與其他細胞(包括癌細胞)的相互作用認識有限,因此,癌癥患者使用靶向血小板的藥物存在明顯的局限性。

2.1 整合素糖蛋白受體抑制劑

2.1.1GPⅡb/Ⅲa抑制劑 在臨床上,GPⅡb/Ⅲa拮抗劑是具有廣泛臨床應用的注冊藥物。目前,FDA批準了3種GPⅡb/Ⅲa抑制劑,包括阿昔單抗(Reopro)、替羅非班(Aggrastat)和依替巴肽 (Integrilin)。替羅非班和依替巴肽是GP-Ⅱb/Ⅲa受體的可逆競爭性抑制劑,對GP-Ⅱb/Ⅲa具有高度特異性[10]。阿昔單抗(Reopro)是FDA于1994年批準的第一個GPⅡb/Ⅲa抑制劑。它是一種人-鼠嵌合單克隆抗體Fab片段,可阻斷血小板和巨核細胞上的GP Ⅱb/Ⅲa受體。阿昔單抗與血小板GPⅡb/Ⅲa受體的結合阻止了纖維蛋白原、血管性血友病因子(vWF)等粘附蛋白分子與GP Ⅱb/Ⅲa受體的粘附作用,從而干擾血小板聚集和血栓形成[12]。

Fig 1 Role of platelets in tumor growth and metastasis

2.1.2GPVI抑制劑 臨床開發中的其他新型抗血小板藥物包括Revacept,一種可溶性二聚糖蛋白VI-Fc融合蛋白,它可以干擾膠原誘導的血小板激活。其已被證明能與血管損傷部位的膠原特異性結合,從而抑制血小板的粘附和聚集。與其他抗血小板藥物不同的是,Revacept被認為可以阻止膠原介導的血小板與動脈粥樣硬化內皮細胞的相互作用,而不會影響出血時間[13]。

2.2 P選擇素拮抗劑在癌癥治療中靶向選擇素的新化合物開始出現。Rivipansel(GMI-1070)是一種人工合成的小分子擬糖物,作為泛選擇素拮抗劑發揮作用,可在體外和體內抑制選擇素結合和選擇素介導的效應。Rivipansel對P-選擇素、L-選擇素和E-選擇素均有抑制作用。這種藥劑已經被證明能夠減少多發性骨髓瘤(MM)惡性漿細胞向骨髓歸巢并增加它們對硼替佐米的敏感性[14]。Crizanlizumab是一種人源化單克隆抗體,可結合并抑制P-選擇素,從而阻斷P-選擇素與其配體PSGL-1的相互作用。2019年11月FDA批準Crizanlizumab用于治療鐮狀細胞病(SCD)的并發癥,以減少16年以上鐮狀細胞疾病患者的疼痛頻率[15]。這種新藥在治療癌癥方面的作用還不清楚。

2.3 蛋白酶激活的凝血酶受體抑制劑PAR1已被證明是一種癌基因,是一種新興的抗癌藥物靶點。PAR1與實體瘤的進展相關,包括原發性生長、侵襲、轉移和血管生成。沃拉帕沙(Vorapaxar)、PZ-128和阿托帕沙(Atopaxar)是3種PAR1抗血小板藥物。Vorapaxar是美國食品和藥物管理局(美國和歐洲)于2014年5月批準的第一種PAR1拮抗劑,用于降低心肌梗塞、中風和心血管死亡的風險,并用于既往心肌梗塞或外周血管疾病患者的血管重建。PZ-128(P1pal-7)是一種很有前途的抗血小板藥物,它在15 min時表現出快速的血小板PAR1抑制,比P2Y12口服藥物氯吡格雷起效更快[16]。PZ-128在乳腺癌小鼠模型中可抑制腫瘤生長和轉移[17]。Atopaxar是一種PAR1小分子抑制劑,以前稱為E5555,是一種雙環脒衍生物,被證明可以抑制凝血酶誘導的人血小板聚集[4]。

2.4 阿司匹林阿司匹林是一種抗血小板藥物,其抗癌活性已經在體外、動物模型和臨床試驗中得到了徹底的研究,已被公認為是一種很有前途的抗癌藥物,但其在化學預防中的確切作用機制尚不十分清楚。阿司匹林是一種不可逆的環氧合酶(COX)抑制劑,通過乙酰化絲氨酸殘基,減少花生四烯酸合成前列腺素E2(PGE2)和血栓素A2(TXA2)。COX-1 在血小板和胃上皮細胞中表達,負責血小板中 TXA2 的產生和胃黏膜中細胞保護性前列腺素的基礎產生[2];COX-2基因是一個具有許多調節位點的主要反應基因。COX-2通常情況下在大多數細胞中都不表達,而在病理條件下,COX-2在癌細胞中過度表達[13]。小劑量阿司匹林通過選擇性乙酰化COX-1的COX活性位點內529位(Ser529)的一個絲氨酸殘基的羥基,引起血小板COX-1活性的不可逆抑制。

2016年,美國預防服務小組建議使用小劑量阿司匹林預防結直腸癌。這是使用抗血小板藥物預防癌癥轉移的一個里程碑事件。阿司匹林的實驗證據也證明了血小板相關的機制。有研究證明,血小板顯著增強卵巢癌細胞的轉移活性,而阿司匹林和P2Y12抑制劑2MeSAMP聯用可抑制血小板功能,破壞轉移性卵巢癌級聯反應中的關鍵外滲步驟,減少腫瘤轉移[18]。阿司匹林在抑制COX-1活性和血栓形成的劑量下減少了B16F10黑色素瘤、MC-38-GFP、4T1和MDA-MB-231-CFP小鼠模型的轉移性肺結節的數量,表明阿司匹林對轉移有廣泛的抑制作用[19]。這些發現強調了阿司匹林在癌癥預防中的血小板依賴性作用。

2.5 ADP P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷(Plavix)是血管疾病治療中應用最廣泛的P2Y12受體拮抗劑[1]。有研究表明,氯吡格雷能夠抑制小鼠胰腺癌晚期自發性血栓形成,并且減少胰腺癌小鼠的腫瘤生長、轉移發展并增加其存活率[20]。

替格瑞洛(Ticagrelor)是一種可逆性口服P2Y12受體拮抗劑。在血小板-腫瘤細胞相互作用的體外模型中,替格瑞洛減少了結直腸癌細胞(HT-29)誘導的血小板聚集和活化,并顯著降低了HT-29在血小板存在下的粘附,同樣在轉移性癌癥患者中,替格瑞洛可以顯著減少自發性血小板聚集。這些發現支持進一步研究替格瑞洛單藥治療在有血栓并發癥(例如靜脈血栓栓塞)風險的癌癥患者群體中的潛在作用[21]。

P2Y12拮抗劑和癌癥風險之間的關系仍有爭議。雙重抗血小板治療(DAPT)通常是阿司匹林和P2Y12拮抗劑的組合,通常用于預防和治療心腦血管和周圍血管疾病。因此延長DAPT持續時間是否能為治療心血管疾病帶來更大的益處呢?有研究比較了ACS患者藥物洗脫支架置入后使用噻吩吡啶延長DAPT 30個月與12個月的療效和安全性,結果發現,在死亡病例中,延長DAPT組的新實體瘤發病率較高,與癌癥相關的死亡病例顯著增加。FDA對這項研究的評估發現,癌癥診斷相對增加了約60%,癌癥相關死亡率也相應增加[22]。之后,FDA報告了兩項試驗級薈萃分析的高水平匯總統計數據,探討了氯吡格雷與癌癥的相互作用。一項薈萃分析側重于癌癥相關的不良事件,包括四項試驗(37 835名患者),而第二項薈萃分析評估了五項試驗(40 855名患者)的癌癥相關死亡。這兩項薈萃分析均否定了DAPT與氯吡格雷患者癌癥相關性的假設。因此,FDA得出結論,氯吡格雷對癌癥沒有影響[23]。考慮到現有證據,可以謹慎地假設P2Y12拮抗劑治療在癌癥風險方面是安全的。

2.6 磷酸二酯酶抑制劑磷酸二酯酶(PDE)催化細胞內cAMP和cGMP水解為失活的5‘AMP和5’GMP。血小板表達PDE2、PDE3和PDE5,它們被抑制會提高cAMP,cGMP在血小板內的水平,從而抑制血小板的激活。在作為抗血小板藥物開發的選擇性PDE抑制劑中,西洛他唑(Cilostazol)和雙嘧達莫(Dipyridamole)已被探索為可能的癌癥輔助治療。西洛他唑已廣泛應用于外周血管疾病患者,它通過激活環磷酸腺苷(CAMP)來抑制PDE3的產生。是血小板和平滑肌細胞中PDE3的特異性和強效抑制劑[5]。西洛他唑通過選擇性地抑制PDE3,減少人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力,同樣在小鼠MDA-MB-231乳腺癌模型中,給予西洛他唑可顯著抑制腫瘤生長和轉移[24]。雙嘧達莫是一種冠脈擴張劑,目前正作為抗血栓藥物與阿司匹林聯合用于卒中的二級預防。雙嘧達莫不僅通過作為PDE5和PDE3的抑制劑來抑制血小板功能,而且還通過抑制紅細胞對腺苷的再攝取來抑制血小板功能[5]。雙嘧達莫作為甲磺酸伊馬替尼的佐劑所提供的有益作用可以改善甲磺酸伊馬替尼的化療作用并減輕其嚴重的肝毒性。此外,二者聯用可以增加腫瘤內甲磺酸伊馬替尼濃度、增強凋亡途徑、抑制癌細胞增殖和血管生成,有著優越的抗癌活性[25]。

Tab 1 Platelet receptors that affect tumors and drug candidates targeting these receptors

3 其他治療策略

3.1 靶向與癌細胞上的血小板相互作用的相應受體預防血小板與癌癥相互作用的一種方法是靶向血小板。可以合理地推測,靶向與癌細胞上的血小板相互作用的相應受體也可以抑制癌癥轉移。有研究描述了一個限制原位腫瘤細胞與腫瘤微環境(TME)之間直接接觸的自組裝策略。通過涂有透明質酸(HA)的脂質體靶向腫瘤的Lys-Leu-Val-Phe-Phe(KLVFF)肽基序 ,并自發地組裝形成網狀結構的納米纖維,包裹在腫瘤細胞周圍。纖維納米結構掩蓋了膜的突起,從而阻礙腫瘤細胞的遷移和侵襲。腫瘤細胞上的納米纖維涂層顯著阻斷腫瘤細胞誘導的血小板聚集,在體外誘導血小板聚集,防止血小板在體內循環腫瘤細胞(CTC)周圍粘附,從而限制了血小板的促轉移作用,防止了早期轉移。此外,納米網在原發腫瘤部位穩定保留72 h以上,有效防止腫瘤內血小板活化,抑制腫瘤進展和4T1乳腺癌小鼠模型中自發性肺轉移[26]。

3.2 血小板膜包覆的納米顆粒膜包覆的納米顆粒具有生物相容性,血液循環時間增強,并且對腫瘤細胞具有天然靶向性,因此被廣泛研究。使用不同形式的細胞膜裝飾各種納米顆粒,包括紅細胞、白細胞、血小板、干細胞、癌細胞,甚至細菌或它們的雜交種。來自血小板的細胞膜在保護納米顆粒免受免疫系統和血液清除方面顯示出了較好的效果[27]。Hu等[28]首次報道了包裹在人血小板質膜中的聚合物納米顆粒的制備,他們通過反復凍融法制備了血小板膜,并通過簡單的超聲實現了膜包被。在這項開創性的工作之后,許多血小板膜包被的納米顆粒被設計成將抗癌藥物遞送到CTC或TME。聶廣軍等通過將血小板膜與功能化合成脂質體相結合來構建納米載體。由于其基于血小板膜的偽裝,它具有增強的腫瘤親和力,可以通過酸性TME(pH 6.8)和溶酶體微環境(～pH 5)的觸發釋放化療藥物。在小鼠結腸癌細胞系CT26,小鼠乳腺癌細胞系4T1癌癥模型中,它顯示出比不具有pH反應性的納米制劑或基于傳統pH敏感脂質體的納米制劑更好的抗腫瘤效果[29]。

使用血小板膜包覆納米顆粒進行治療藥物遞送是一種有效策略,但同樣面臨著一些問題,比如大規模生產的局限性,安全性等。如果納米顆粒沒有被血小板膜完全覆蓋或膜在儲存過程中脫落,隨著內部材料的暴露,有很大的可能在循環和器官中引起副作用。因此,必須仔細研究其在體外和體內的長期穩定性。癌癥相關血小板靶向納米藥物的設計應足夠仔細,以防止可能的風險[27]。

4 靶向血小板治療癌癥的挑戰

目前的抗血小板藥物永久性地抑制血小板聚集的靶點,但是出血風險仍然難以避免。在開發干預血小板-癌細胞相互作用的治療藥物時,需要思考的問題是如何在維持正常的血小板止血功能的同時,又能抑制血小板中起促癌作用的靶點。深入了解血小板和腫瘤細胞之間相互作用的信號通路將有助于確定靶向治療策略,從而阻斷血小板-腫瘤細胞相互作用。已有的抗血小板藥物不能完全滿足臨床需求,目前所有可用的抗血小板藥物都存在限制其臨床療效的缺點。例如,阿司匹林的使用與嚴重的胃腸道副作用有關,患者大出血風險增加[30];替格瑞洛最常見的副作用是呼吸困難和輕微出血[21]。鑒于該現狀,人們致力于尋找更加安全有效的抗血小板藥物,尋找抗血小板的新作用靶點。由于人們生活方式的改變,出現了新的挑戰,比如人們患肥胖、糖尿病等代謝性疾病的人數增加,而這些疾病會影響到抗血小板藥物的治療,使問題更復雜,所以個性化治療顯得尤為重要。

如今已開發了一些新的抗血小板藥物,但還未上市。抗血小板藥物的研發存在著許多挑戰和阻礙,因此更應該高度關注,以便充分揭示其復雜的作用及機制。設想一下,未來抗血小板藥物的設計也許還可能對抗腫瘤血管生成或腫瘤血管正常化具有選擇性作用。