快速老化SAMP6小鼠骨代謝及其分子機制研究進展

馬紹勇,楊 夢,王佳佳,楊亞軍

(廣東醫科大學藥理學教研室,廣東天然藥物研究與開發重點實驗室,廣東 湛江 524023)

老年性骨質疏松(senile osteoporosis,SOP)及其所致脆性骨折是醫療費升高的原因之一。年老體衰,骨量漸失,骨質量下降,但SOP癥狀隱匿,后果嚴重,診療滯后[1]。因此,盡早地預防、診斷和治療SOP,是老齡化社會亟待解決的重要問題之一。SOP的發病過程復雜,機制未明,目前仍需憑借實驗動物開展廣泛而深入的研究,根據需要可以選擇自然衰老性SOP模型、快速老化SOP模型和D-半乳糖致衰老性SOP模型[2]。自然衰老性SOP模型存在死亡率高、管理成本高、實驗周期長等諸多弊端,而快速老化小鼠P6品系(senescence accelerated mouse prone 6,SAMP6)小鼠是通過AKR/J系小鼠近交繁殖培育出的一種模型小鼠,具有衰老快、壽命短(平均約7.9個月)、骨骼早衰等特征,表現為骨微結構受損、骨量減少和骨脆性增加,是目前公認的SOP模型之一[3]。本文綜述了SAMP6小鼠骨骼的力學性能、微結構和基質組成,并總結了遺傳基因、功能分子等與骨代謝相關的機制。

1 SAMP6小鼠的骨生物力學性能

骨生物力學性能是評估骨質量的直接可靠方法,可用于評價骨骼在受外力作用后的力學特性和生物效應。相比于SAMR1小鼠,SAMP6小鼠在整體上顯示較差的力學性能。全骨模量降低了23%,屈服強度降低了37%,極限強度降低了40%,全骨韌性降低了62%。此外,SAMP6小鼠的脛骨硬度和彎曲矩減少了20%～25%。在股骨方面,屈服力矩和最終力矩分別減少了20%和35%,關節位移和骨折能量減少了70%[4]。這些結果表明,SAMP6小鼠的脛骨和股骨易碎、韌性差、抗骨折能力較弱。然而,與脛骨和股骨不同的是,SAMP6小鼠的椎骨在力學性能上與SAMR1小鼠相比,差異無顯著性。盡管椎骨骨小梁體積減少,但這一變化被骨質礦化和皮質骨厚度的增加所抵消[5],說明椎骨和四肢骨在力學性能上存在差異。進一步觀察四肢骨,相比于SAMR1小鼠,SAMP6小鼠的股骨和脛骨的皮質骨模量增加了8%,硬度增加了11%。此外,股骨的皮質骨模量和硬度均高于脛骨[6],表明SAMP6小鼠的皮質骨礦化程度高,且硬度較大。另有研究發現,低、中、高強度運動可以提高SAMP6小鼠股骨的斷裂強度,從而改善其生物力學性能[7]。這一發現對于預防和治療骨質疏松癥具有重要意義。總之,SAMP6小鼠在整體和四肢骨方面均表現出較差的生物力學性能特征。

2 SAMP6小鼠的骨微結構特征

從整體來看,SAMP6小鼠與SAMR1小鼠在椎骨高度、股骨、脛骨長度、骨組織重量等方面,差異無顯著性,但骨組織微結構的各項指標均發生了不同程度的改變。在椎骨方面,隨著年齡增長,SAMP6小鼠的椎骨總面積和骨內面積增加了15%和38%,而皮質骨厚度減少了18%[5]。此外,SAMP6小鼠椎骨的骨小梁體積分數(bone volume/total volume,BV/TV)在不同區域呈現差異,中部區域小于1%,而頂端和尾端比SAMR1小鼠減少了35%。SAMP6小鼠的骨小梁結構模型指數(structure model index,SMI)明顯高于SAMR1小鼠[5]。這表明椎骨在不同區域的骨小梁變化不同,且骨小梁形狀發生了改變。在股骨和脛骨方面,SAMP6小鼠的骨髓腔面積、骨內膜周長和骨外膜周長均高于SAMR1小鼠,但皮質骨面積和厚度差異無顯著性[8]。然而,股骨和脛骨松質骨中的骨小梁發生了不同變化。與SAMR1小鼠相比,SAMP6小鼠的股骨BV/TV下降了15%～16%,骨小梁數量(trabecular number,Tb.N)和骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)也明顯降低,而骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)和骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,TB.Pf)則明顯增加。SAMP6小鼠的脛骨中BV/TV下降了18%,同時Tb.N、Tb.Th、SMI、TB.Pf與股骨的變化趨勢相似[9]。這表明SAMP6小鼠的股骨、脛骨與SAMR1小鼠相比,在外觀上沒有明顯差別,但骨組織微結構中的骨小梁數量減少,分離度增大,桿狀結構增多,骨微結構受到了一定程度的損傷。

骨形態計量學參數進一步說明了SAMP6小鼠的骨量和骨形態的變化。與3月齡SAMR1小鼠相比,同齡的SAMP6小鼠股骨的骨小梁吸收表面長度、骨礦沉積率和骨小梁面積明顯減少,表明SAMP6小鼠具有骨吸收活躍、骨形成減少和低骨量的特點。與3月齡SAMP6小鼠相比,6月齡SAMP6小鼠的皮質骨寬度平均數和類骨質面積明顯減少,表明隨著年齡的增加,骨質疏松程度進一步加重。這些骨形態計量學參數顯示SAMP6小鼠骨微結構受到了破壞,是骨吸收加快和骨形成減少共同作用的結果[10]。

綜上所述,SAMP6小鼠的椎骨、股骨和脛骨與SAMR1小鼠在外觀上無明顯差異,但出現骨微結構損壞、骨代謝失衡、骨量低下等骨質疏松的發病特征,且嚴重程度隨年齡增加進一步加劇。

3 SAMP6小鼠的骨基質組成成份

骨基質由有機質和無機質組成。有機質中的膠原纖維占90%以上;無機質主要由鈣、磷、鎂等成分組成,以羥磷灰石結晶的形式存在。骨密度(bone mineral density,BMD)是評價骨礦含量水平的國際金標準之一[11]。在SAMP6小鼠骨骼的有機質中,總蛋白減少5%,膠原含量減少13%,且定向性較差[12]。在無機質方面,SAMP6小鼠的骨鈣、骨磷水平明顯降低,而血鈣、血磷水平明顯升高,表明骨骼的無機質流失加快。SAMP6小鼠的椎骨灰分增加18%,有機含量降低11%,水分降低了28%,表明其椎骨礦化程度更高[5]。SAMP6小鼠的BMD測量結果表明,頭部區域的BMD最高,其次是脊柱、尾巴和腿部[13]。在1月齡時,SAMP6小鼠全身的BMD與SAMR1小鼠相比差異無顯著性,但在2月齡時開始低于SAMR1小鼠;兩者的全身BMD在4～5月齡時達到峰值,SAMP6小鼠的峰值較低。然而,SAMP6小鼠的全身骨礦含量和骨組織面積持續增加至8月齡[14],原因未明。總之,隨著年齡增加,SAMP6小鼠的膠原和總蛋白含量降低,而灰分和礦物質含量增加,這種無機質和有機質水平的變化對于研究SOP提供了重要參考。

4 SAMP6小鼠的骨代謝細胞和功能分子

骨髓中存在多種與骨代謝相關的細胞,包括骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)、骨骼干細胞(skeletal stem cells,SSCs)、成骨細胞、破骨細胞、脂肪細胞等,在骨代謝中均發揮重要作用。與SAMR1小鼠相比,1～2月齡SAMP6小鼠BMSCs數量差異無顯著性,在3～4月齡時,BMSCs數量減少,并伴隨骨形成下降和骨量減少[15]。在衰老過程中,SAMP6小鼠的骨細胞和成骨細胞衰退,出現線粒體腫脹和髓鞘樣結構[16],破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶陽性率較高,破骨活性增強[17],過氧化物酶體增殖物激活物γ的表達增加,脂肪細胞分化增強[18]。體外培養的SAMP6小鼠BMSCs的細胞增殖和代謝活性降低,細胞凋亡比例增高,成骨分化潛能受損,脂肪分化能力增強[15,19-20]。這些現象提示,SAMP6小鼠的BMSCs出現衰老的特征。總之,SAMP6小鼠骨量低下是多種細胞共同作用的結果。近年來,SSCs對骨骼發育和修復的作用越來越受到重視,但其在SAMP6小鼠中的研究尚未見報道。

SAMP6小鼠的骨代謝過程受到多種因素的調控,其中甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是重要的參與者之一。與SAMR1小鼠相比,SAMP6小鼠的甲狀旁腺分泌顆粒數量增加,甲狀旁腺顆粒內質網和高爾基復合體體積增加,而溶酶體體積減少[21],呈甲狀旁腺功能亢進狀態。此外,SAMP6小鼠的尿cAMP和尿鈣水平較高,血鈣、血磷和PTH水平也明顯升高,提示甲狀旁腺功能亢進會導致骨吸收增加,骨量減少[22]。研究表明,PTH對皮質骨和松質骨的作用相反:一方面,低劑量PTH可以增加皮質骨中c-fos的表達,促進破骨細胞成熟,增強骨吸收,抑制Ι型膠原的合成,阻礙成骨細胞介導的骨形成活動,導致皮質骨孔隙率增大,骨密度降低[23];另一方面,低劑量PTH可以改善SAMP6小鼠松質骨骨小梁微結構,增加干骺端的骨強度[24]。白介素11(interleukin 11,IL-11)作為一種抑炎因子,也會影響SAMP6小鼠的骨代謝過程。在SAMP6小鼠骨髓基質細胞中,IL-11表達減少,若增強TGF-β水平和AP-1活性,有可能促進IL-11表達的增加,破骨細胞和成骨細胞的生成也相應增強[25];補充IL-11,則會抑制成脂分化,同時會促進成骨分化與破骨分化[18]。可見,PTH的增加和IL-11的異常減少可能是導致SAMP6小鼠骨代謝異常的主要原因。

5 SAMP6小鼠的遺傳基因和分子機制

SAMP6小鼠具有骨密度低下、遺傳穩定的特征,其骨量主要受多個基因的共同調控,但與骨骼相關的基因位于不同染色體上。簡言之,第11號染色體上的位點可以調控骨內膜和骨膜的形成,從而影響股骨橫斷面的形狀。13號染色體上的Pbd2位點與成熟前的骨形成有關,是增加峰值骨密度的位點,并能增加干骺端的骨小梁和皮質骨體積,但不影響骨骼的幾何形狀[26]。X染色體上的Pbd3位點與成熟后的骨丟失率相關,但不影響峰值骨量[27]。

Wnt/β-catenin信號通路在骨形成調控中扮演著重要角色。低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6和Frizzled受體與Wnt結合,促進β-catenin轉位入核,與TCF/LEF轉錄因子相互作用,最終激活成骨細胞的分化[28]。分泌型卷曲相關蛋白4(secreted frizzled-related protein 4,SFRP4)作為受體阻遏物,妨礙Wnt信號在細胞內的傳遞,抑制成骨分化,導致骨密度下降。在SAMP6小鼠中,SFRP4的表達水平明顯增高,影響骨代謝過程。然而,在松質骨和密質骨中,SFRP4的作用途徑并不一致。松質骨缺失SFRP4基因,典型的Wnt信號通路激活,骨小梁數量增加;皮質骨缺失SFRP4基因,通過激活非典型的Wnt通路,增強BMP信號,導致硬化蛋白表達增加,皮質骨變薄[29]。低劑量PTH和IL-11通過激活Wnt/β-catenin信號通路,促進骨形成。研究表明,PTH通過抑制MEF2C的表達,降低骨硬化蛋白(sclerostin,SOST)的表達,從而促進Wnt信號傳遞,增加骨密度。另據報道,IL-11通過抑制Dickkopf相關蛋白1(Dickkopf-related protein 1,DKK1)和DKK2的表達,激活Wnt/β-catenin信號通路,促進成骨細胞分化[30]。然而,在SAMP6小鼠中,IL-11是否通過DKK1和DKK2來激活Wnt/β-catenin信號通路,目前尚不明確(Fig 1)。

Fig 1 SAMP6 mouse bone metabolism-related

綜上所述,SAMP6小鼠是一種用于研究SOP分子機制的模型。盡管已經取得了一些進展,但仍需要進一步的研究來揭示SAMP6小鼠SOP的詳細機制和潛在治療靶點。

6 總結與展望

SAMP6小鼠具有遺傳穩定、骨量低下等特點,在骨骼形態、結構組成和BMD力學性能方面均與人類相似,椎骨除外。SAMP6小鼠骨量低下的原因較為復雜,根據現有的研究報道,其發病機制可能與BMSCs衰老、成骨細胞減少、破骨細胞與脂肪細胞增多、IL-11和PTH表達異常有關。目前,以SAMP6小鼠作為模型研究與開發防治SOP的藥物,已經取得了一系列研究成果,尤其是抗骨質疏松中藥及其天然產物。例如,黃芪可以通過Vitamin-D/FGF-23/Klotho通路影響骨形成活動,進而提高鈣、磷含量,改善SAMP6小鼠骨質疏松[31]。白藜蘆醇能夠增強線粒體功能,改善細胞代謝,促進成骨分化,從而增加SAMP6小鼠的骨形成功能[32]。肉蓯蓉總糖苷和肉蓯蓉多糖可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路,改善SAMP6小鼠的骨質疏松癥狀[33]。此外,小檗堿、干發酵大豆食品、膳食根皮苷、補腎壯骨顆粒均可提高SAMP6小鼠BMD,對SOP具有很好的治療潛力。前述研究為解決老齡化社會中SOP問題提供了有希望的治療策略,并促進了對SOP發病機制的深入了解,為未來進一步研究和臨床應用奠定了基礎。