COPD細胞微環境體外模型建立的思路與方法

秦燕勤,劉 含,李建生

(1.河南中醫藥大學 河南省中醫藥防治呼吸病重點實驗室 呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心,河南 鄭州 450046 2. 河南中醫藥大學中醫藥科學院,河南 鄭州 450046;3. 河南中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科,河南 鄭州 450003)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續性呼吸道癥狀和不完全可逆性氣流受限為主要特征的疾病,其病理機制復雜,包括炎癥反應、氧化應激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、黏液高分泌、血管損傷等,涉及多種細胞及介質。細胞微環境改變是COPD病理生理的重要組成部分。模擬細胞病理微環境是COPD機制研究及藥效藥理評價的重要方法。單層細胞培養無法模擬細胞間的相互作用,在應用方面有一定的局限性。細胞共培養技術可較大限度模擬COPD多細胞相互的微環境,為COPD的病理機制及藥效研究提供模型工具。鑒于上述,本文基于近年來研究背景,總結現有模擬COPD病理微環境的細胞模型,分析模型的適用性,提出COPD細胞微環境病理模型建立的思路與方法,旨在為COPD的病理及藥物作用機制研究提供參考。

1 肺內細胞微環境的構成

肺內細胞微環境由細胞、細胞外基質、可溶性分子及物理因子構成,以維持肺的正常生理功能。細胞主要包括肺實質細胞、間質細胞、免疫細胞。細胞外基質是分布于細胞外空間、由細胞分泌的蛋白和多糖所構成的網絡結構,如膠原蛋白、彈性纖維、糖蛋白、纖維連接蛋白等,對細胞形態、生長、分化起調控作用。可溶性分子由營養物質和可溶性信號分子組成,如細胞因子、生物活性物質等。物理因子主要包括細胞外基質物理結構、微環境力學特性和其他物理特性等。

肺實質細胞主要有上皮細胞、血管內皮細胞等。支氣管上皮細胞是保護氣道-肺組織免受外源性物質侵襲的第一道生理屏障。肺泡上皮細胞主要包括Ⅰ型和Ⅱ型細胞,Ⅰ型上皮細胞與基底膜、血管內皮細胞組成氣血屏障,維持氣體交換和屏障功能。Ⅱ型上皮細胞內含豐富的板層小體,主要合成、分泌和儲存肺泡表面活性物質,維持肺泡張力。血管內皮細胞是肺血管穩態的主要調節劑,調節血管張力、凝血和血管生成。肺間質細胞主要包括間充質干細胞、成纖維細胞、脂質成纖維細胞、肌成纖維細胞,主要產生細胞外基質,以維持肺的結構和功能。免疫細胞主要包括巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞等固有免疫細胞,適應性免疫細胞T淋巴細胞、B淋巴細胞,共同發揮免疫調節功能。

不同細胞之間通過直接、間接連接、分泌細胞因子、細胞外囊泡等相互作用維持細胞微環境穩態。免疫細胞和肺實質細胞的交互作用對維持細胞微環境穩態至關重要。微環境影響肺泡巨噬細胞的表型分化和功能,其轉錄組的變化完全歸因于微環境[1]。支氣管上皮細胞和巨噬細胞協同作用維持氣道屏障功能,巨噬細胞釋放的介質作用于損傷的氣道上皮細胞,促進氣道上皮修復[2]。巨噬細胞分泌的細胞外囊泡可被上皮細胞內化并抑制炎癥通路的激活[3]。上皮細胞和血管內皮細胞主要參與構成氣-血屏障,維持氣-血交換和屏障功能。血管內皮生長因子參與維持肺泡上皮細胞完整性,阻斷其受體誘導肺泡細胞凋亡和氣腫樣疾病[4]。巨噬細胞也參與調節氣血屏障功能,發揮屏障免疫和異物清除作用,維持肺內環境穩態[5]。上皮細胞和間質細胞的相互作用對細胞增殖、分化和細胞外基質的產生至關重要,成纖維細胞通過釋放炎癥介質和生長因子調控上皮細胞表型[6]。

2 細胞微環境變化是COPD病理生理的重要組成部分

COPD病理機制復雜,其特征性病理變化是氣道、肺實質及肺血管的慢性炎癥反應,由多種細胞及介質參與。由香煙煙霧(cigarette smoke,CS)、細菌、病毒等微生物、PM2.5等顆粒物及缺氧等激活的巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞及上皮細胞等肺實質細胞,釋放炎癥介質,引發炎癥反應,損傷肺實質。激活的巨噬細胞、上皮細胞等不僅釋放炎癥介質,還可促進中性粒細胞的募集和活化,增強炎癥信號,產生瀑布樣炎癥反應,促進COPD病理進展[7-8]。

COPD炎癥反應可作為始動因子,啟動其他一系列病理進程。氧化應激和炎癥反應在COPD病理進程中相互作用,相互促進[7]。巨噬細胞等免疫細胞釋放的炎癥因子刺激氣道上皮細胞向杯狀上皮細胞化生,促進氣道黏液分泌,造成黏液積聚,誘導COPD患者咳嗽、咯痰,加重呼吸道癥狀[9]。炎癥刺激可直接損傷血管內皮細胞,使其結構和功能發生改變,并抑制內皮修復,促進微血管形成,導致血管重構,誘發肺動脈高壓的發生,增加COPD患者死亡風險[10]。炎癥因子的刺激破壞細胞外基質,導致蛋白酶/抗蛋白酶失衡,引起膠原沉積,降解的基質又會加劇炎癥反應,加快氣道重塑的進程[6]。由于氣流受限,COPD患者長期處于缺氧狀態,血管內皮細胞對缺氧十分敏感,持續缺氧刺激可損傷內皮細胞,導致氣血屏障結構改變和功能障礙,影響機體氣血交換,加重氣流受限,加速COPD病理進展[11]。COPD發生發展中,細胞微環境變化復雜,涉及方面較多,每一方面并不是獨立的,而是相互作用,共同促進COPD病理進程。見Fig 1。

3 COPD細胞微環境病理模型建立的思考

肺內細胞微環境受多種因素影響,COPD疾病進展是多細胞相互作用的結果。目前,體外多以細胞為載體,模擬COPD病理微環境,探討COPD發病機制及藥物作用機制。采用外源性刺激物,如CS、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、細胞因子、顆粒物、缺氧等誘導肺實質或免疫細胞,模擬COPD炎癥反應、黏液高分泌、肺實質損傷等病理過程,以探討COPD的病理及藥物作用機制,見Tab 1。

然而,任何病理環節都不是單一的細胞起作用,而是多細胞相互作用的結果,借助現有的細胞培養支持物進行多細胞共培養可建立接近肺內細胞微環境的模型。肺是空腔器官,氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞一面是朝向氣管腔或肺泡腔的游離面,一面是朝向深部組織的基底面,呈現出明顯的極性,必須模擬細胞的生理極性,才能建立符合機體生理狀態的體外模型。目前關于氣道黏液高分泌的模型,多將氣道上皮細胞培養于液體培養基液面以下,分泌型粘蛋白生成量不理想,通過檢測黏蛋白基因表達評價模型[16,23]。這可能是由于該培養方法無法模擬氣道上皮細胞的生理極性,杯狀細胞化生受限導致的。可以采用氣-液面培養模擬氣道上皮細胞的生理極性建立病理模型。氣血屏障是肺進行氣體交換的結構,是阻止肺泡中外源性物質入侵機體的一道物理屏障,體外可模擬這種肺微環境特殊生理結構。類器官可再現肺空間結構和肺內環境與細胞間的相互作用,在肺發育、生理功能、疾病病理和藥物作用機制研究中應用較多。

Fig 1 Changes of cellular microenvironment promote COPD disease progression

Tab 1 Application of different inducers to induce different cells in COPD study

因此,結合COPD細胞微環境的變化,建立細胞微環境的病理模型可為COPD病理機制研究及藥理藥效評價提供工具,對COPD的防治研究極為重要。基于目前常用的研究方法,提出以下模型建立方法。

3.1 模擬COPD多細胞相互作用微環境的細胞共培養COPD細胞微環境涉及多種細胞及介質,單層細胞培養無法模擬多細胞相互作用的微環境。將兩種或兩種以上細胞共培養構建體外模型,有利于探討細胞間相互作用關系,模擬COPD多細胞相互作用的微環境。以往的研究多集中在兩種細胞類型共培養。Wang等[18]將肺泡上皮細胞、巨噬細胞共培養,研究環境PM2.5的潛在毒性。脂多糖誘導共培養的上皮細胞、巨噬細胞模擬COPD炎癥反應微環境,結果表明與單層細胞培養比較,共培養可放大脂多糖誘導的炎癥反應[19]。Li等[20]用CS誘導共培養的A549細胞和THP-1細胞,發現CS誘導下,巨噬細胞可促進肺泡上皮細胞發生EMT。3種及以上細胞類型共培養更適宜模擬COPD多細胞相互作用的微環境。上皮細胞、巨噬細胞、內皮細胞、肥大細胞四種細胞共培養模擬PM10刺激時,肺細胞間交互作用,發現四種細胞共培養可釋放更多的炎癥因子,且肥大細胞起重要作用,該模型可為研究不同細胞類型對顆粒物的效應機制提供工具[24]。為模擬COPD病理狀態下多細胞相互作用的微環境,可以將3種或3種以上細胞類型共培養,根據研究目的,選用CS、LPS、PM、細胞因子或缺氧為刺激因素,模擬氣道黏液分泌、炎癥反應、實質細胞損傷、巨噬細胞分化等不同的病理環節,為疾病發病機制研究提供工具。具體實施可采用直接接觸共培養法,也可借助Transwell將不同類型細胞接種在培養板和Transwell多孔膜兩面進行細胞共培養。見Fig 2。

Fig 2 Cell co-culture that mimic multicellular interaction

Fig 3 Air-liquid surface cell culture that mimic cell polarity

3.2 模擬上皮細胞極性的氣-液面細胞培養氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞存在明顯的極性,模擬這種生理狀態,可建立接近細胞微環境的體外模型。氣道上皮細胞多被用于模擬黏液高分泌微環境探討COPD黏液高分泌機制及藥物作用機制。傳統的氣道上皮細胞培養,細胞被接種于培養基液面以下,這不能完全模擬氣道生理環境,氣道上皮細胞向杯狀細胞分化受到限制,黏蛋白分泌量較低[16,23]。氣-液面培養的主要特征是細胞的基底面與液體培養基接觸,其頂端表面暴露于空氣中,模擬細胞的生長極性,模擬人呼吸道生理環境,誘導細胞向黏膜纖毛表型分化。由于氣道上皮細胞生長于多孔膜的上表面,下表面還可以選擇性的接種巨噬細胞等免疫細胞,模擬氣道黏液高分泌的多細胞相互作用微環境。Schwab等[25]建立了支氣管上皮細胞與巨噬細胞共培養體系,通過檢測黏液和炎癥因子分泌探討上皮細胞與巨噬細胞的相互作用。建立該培養系統可采用Transwell小室,將氣道上皮細胞接種于Transwell小室多孔膜上,細胞上表面暴露于空氣中,通過多孔膜接觸培養基,誘導其分化為杯狀細胞。該模型可用于研究COPD發病機制及藥物作用機制,特別是黏液高分泌機制及藥物抑制黏液高分泌的作用機制與靶點。見Fig 3。

3.3 模擬肺氣-血屏障的上皮細胞與內皮細胞共培養氣血屏障位于呼吸系統肺泡與循環系統連接處,是機體進行氣體交換的場所。因頻繁接觸隨呼吸而來的外源性物質,氣血屏障還是外源性物質入侵循環系統的門戶。COPD病理進程中,氣血屏障結構和功能受損,建立模擬肺氣血屏障的肺泡上皮細胞與內皮細胞共培養模型,可為研究氣血屏障損傷機制及藥物作用機制提供工具。Lan等[26]采用Transwell建立了氣血屏障,探討氣血屏障對PM2.5的屏障作用及細胞相互作用在細顆粒物刺激時的作用。Benam等[27]將內皮細胞和COPD患者肺分離的肺泡上皮細胞和共培養,模擬氣血屏障,以檢測肺內皮細胞和上皮細胞對細胞因子分泌的協同作用。模擬氣血屏障的生理結構,可借助Transwell小室膜模擬基底膜,將內皮細胞與上皮細胞分別接種在膜的兩面,也可在下層培養基中接種巨噬細胞等,以模擬氣血屏障結構。見Fig 4。

Fig 4 Cell co-culture mimicking alveolar-capillary barrier

3.4 模擬肺組織結構的肺類器官培養多細胞共培養雖易操作,可較大限度模擬COPD細胞微環境,但不能準確再現肺空間結構和肺內環境與細胞間的相互作用。類器官具有與原生器官相似的空間組織和部分功能,是目前最接近人體組織系統的模型,用于模擬器官發育和疾病病理。

Fig 5 Differentiation of lung organoid

肺類器官用于研究肺發育、生理功能、疾病病理和藥物作用機制。肺類器官可主要來源于成熟肺組織的上皮祖細胞(包括基底細胞、氣道分泌細胞、肺泡II型上皮細胞)和多能干細胞,根據研究目的選擇肺不同區域的細胞在細胞外基質中進行分化,以更準確地模擬肺疾病病理生理。肺基底細胞可產生氣道的主要管腔上皮譜系,其分化的類器官可用于研究肺部疾病的氣道病變病理機制,如氣道黏液分泌、氣道屏障功能、氣道炎癥和損傷及其潛在治療。肺泡II型上皮細胞功能障礙是多種肺部疾病發病機制的主要原因,以此為來源的類器官應用更廣泛,可用于研究多種疾病發病機制及藥物篩選。Tan等[28]研究發現原代支氣管上皮細胞分化的氣道類器官管腔MUC5AC分泌增加,且隨時間推移,MUC5AC分泌持續增加,這與氣道類器官中杯狀細胞和氣道分泌細胞分化一致。Barkauskas等[29]基于氣道類器官研究基底細胞中固有免疫通路的持續激活促進杯狀細胞化生和氣道重塑,該模型可作為研究COPD黏液高分泌和纖毛損傷及其藥物作用通路的工具。Ⅱ型肺泡細胞分化的肺泡類器官多用于研究肺實質病理損傷機制。Ng-Blichfeldt等[30]采用原代小鼠和人肺泡上皮細胞分化的肺類器官探討視黃酸信號通路在COPD上皮損傷修復中的作用,發現抑制該通路可促進來自小鼠和COPD患者肺組織的肺類器官的增殖。見Fig 5。

4 討論

COPD病理機制復雜,涉及多種細胞類型,細胞微環境變化是COPD病理生理的重要組成部分,在COPD病程進展中扮演重要角色。細胞微環境體外模型建立是研究細胞間通訊和宿主-病原體相互作用的一種新病理模型,也是研究疾病病理、藥物作用機制及毒性分析的有力工具。肺泡上皮細胞、氣道上皮細胞、內皮細胞、巨噬細胞等單層細胞培養簡單、易操作,被廣泛應用于COPD的病理機制及藥物作用機制研究。但是,單層細胞培養無法模擬COPD發生時,多細胞相互作用的微環境。兩種或兩種以上細胞共培養代替單層細胞培養建立多細胞相互作用的COPD病理微環境模型。特定細胞的共培養還可以模擬肺的特殊結構,如肺泡上皮細胞與內皮細胞共培養模擬氣-血屏障等。這些細胞共培養模型為COPD的發病機制及藥理藥效研究提供了工具。

多細胞共培養可較大限度模擬COPD細胞微環境,但不能準確再現肺空間結構。肺類器官能模擬組織的關鍵結構和功能,很大程度上推進了COPD的研究,但也有一定的局限性,肺類器官缺乏血管系統、結締組織、免疫細胞等微環境。未來的研究可將不同細胞來源的類器官進行共培養以克服這些局限。

綜上所述,COPD細胞微環境的體外模型建立可為COPD的病理機制及藥理藥效研究提供工具,是推動COPD防治研究的重要組成部分,可為COPD的治療提供新思路。然而,如何建立更接近人體肺生理環境的模型,如何建立模擬肺生理功能的模型等是需要進一步研究的問題。