固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法快速測定豬肉中β-受體激動劑殘留

師忠義 李鑫 潘明迪 李雅靜 張磊

【摘要】目的：建立同時測定豬肉中β-受體激動劑的快速分析方法。方法：選用自制檢測試劑盒進(jìn)行提取和凈化，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，以0.1%甲酸水+0.1%甲酸/乙腈作為流動相，梯度洗脫。結(jié)果：加標(biāo)水平為0.5、1、5μg/kg時，回收率均在70.8%～92.0%之間，相對偏差在8.9%～15.2%之間，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。結(jié)論：本方法簡便、快捷，可適用于同時測定豬肉中β-受體激動劑的殘留量。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；β-受體激動劑；豬肉

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.01.001

【基金項目】遼寧省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（2022ZC022）。

Determination ofβ-Agonists Residues in Pork by Spe-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHI Zhongyi*， LI Xin， PAN Mingdi， LI Yajing， ZHANG Lei

（Chaoyang Inspection and Testing Center， Chaoyang 122000， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid analysis method for simultaneous determination ofβ-receptor agonists in pork. Methods： Using self-made detection kits for extraction and purification， high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） was employed with 0.1% formic acid water + 0.1% formic acid/acetonitrile as the mobile phase， followed by gradient elution. Results： At the spiked levels of 0.5， 1， and 5μg/kg， the recoveries ranged from 70.8% to 92.0%， and the relative deviations were between 8.9% and 15.2%. The correlation coefficients were all greater than 0.999. Conclusion： This method is simple and rapid， and can be applied for the simultaneous determination ofβ-receptor agonist residues in pork.

Keywords： UPLC-MS/MS；β-agonist； pork

β-受體激動劑屬于腎上腺素類興奮劑，具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)。它不是獸藥，也不屬于添加劑，可以促進(jìn)畜禽生長，減少脂肪生成，提高畜禽組織瘦肉率。由于β-受體激動劑在畜禽產(chǎn)品中有較高殘留，會對人體健康造成極大的傷害，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致人死亡。因此國家將其列為畜禽產(chǎn)品中禁用藥物。

目前，畜禽產(chǎn)品中β-激動劑類藥物殘留常用的檢測手段包括質(zhì)譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法等技術(shù)。UPLC-MS/MS法具有分析時間短、儀器精密度和靈敏度高、抗干擾性強和檢測出的假陽性率低等特點，目前已成為藥物殘留分析的主要檢測手段。然而，國內(nèi)報道的提取、凈化方法多采用SPE（固相萃取）法，該方法操作步驟煩瑣、耗時，且多以測定一種或者幾種β-激動劑類藥物殘留為主，不能全面監(jiān)測畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑的殘留情況。而畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全涉及人民群眾的飲食安全，因此本文建立了同時測定β-受體激動劑的快速分析方法。該方法自動化程度高，操作簡便且快速，為大批量β-激動劑類藥物殘留量的檢測提供了參考[1-8]。

1.1儀器

1290-6420型超高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；BSA224S-CW型電子分析天平（美國賽多利斯公司）；H1850高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)有限公司）；可調(diào)式旋渦混合器（賽默飛世爾科技中國有限公司）；MTN-2800D型氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；SPE快速前處理裝置（賽默飛世爾科技中國有限公司）；超純水機(jī)（賽默飛世爾科技中國有限公司）；8011S型高速組織搗碎機(jī)（美國Waring公司）。

1.2試劑

正己烷、甲醇及乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司）；甲酸（色譜純，天津科密歐試劑有限公司）；快速檢測試劑盒（試劑盒組成見表1，北京六角科技）；實驗用水為一級水。

1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

溴代克侖特羅、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇、特布他林、塞曼特羅、萊克多巴胺、塞布特羅、克倫特羅、溴布特羅、馬布特羅、馬賁特羅、克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3（100μg/mL，天津阿爾塔）。

2.1內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密吸取克倫特羅-D9和沙丁胺醇-D3各100μL，置于10 mL棕色量瓶中，制成濃度為1μg/mL的內(nèi)標(biāo)使用液。

2.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別吸取11種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各100μL，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液。吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液2 mL，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻配制成濃度為200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液。分別精密吸取0.025、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液置于5 mL棕色容量瓶中，分別加入0.25 mL內(nèi)標(biāo)使用液，用0.1%甲酸/乙腈稀釋至刻度并混勻，配成濃度為1、5、10、20、50、100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，同時內(nèi)標(biāo)含量為50 ng/mL。

2.3樣品前處理

2.3.1提取

稱取經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均質(zhì)后的組織樣品2.00 g（精確到0.01 g）置于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)使用液50μL，加入5 mL快速檢測試劑盒中的提取劑1，振搖1 min后，加入8 mL快速檢測試劑盒中的提取劑2，振搖3 min后，以4000 r/min離心3 min，取3 mL上清液于15 mL離心管中，再加入10 mL正己烷，混勻后以4000 r/min離心1 min。

2.3.2凈化

將快速檢測試劑盒內(nèi)部附帶的SPE小柱安裝在固相萃取裝置上，小柱上面接30 mL注射器。將離心好的15 mL離心管中的上清液全部轉(zhuǎn)移至30 mL注射器中，打開固相萃取裝置接頭閥門，開啟真空泵，注意控制流速，待液體全部緩慢流過固相萃取柱后，取下30 mL注射器，繼續(xù)抽真空1 min后，關(guān)閉真空泵。將快速檢測試劑盒內(nèi)的1.5 mL離心管放入固相萃取裝置中，向SPE小柱中加入快速檢測試劑盒內(nèi)附帶的洗脫液1 mL，控制流速，待洗脫液全部緩慢流過SPE小柱，在45℃緩慢氮氣氣流下濃縮至近干，用流動相定容至1 mL，過0.22μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測定。

2.4儀器條件

2.4.1色譜條件

色譜柱：Thermo C18（150 mm×2.1 mm，3μm）；流量：0.2 mL/min；柱溫箱：30℃；進(jìn)樣量：10μL；流動相：A相0.1%甲酸/水，B相為0.1%甲酸/乙腈，后運行3 min。梯度洗脫程序見表2。

2.4.2質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描模式（MRM+）；毛細(xì)管電壓：4 kV；離子源溫度：350℃；干燥氣流流速：11 L/min；霧化器壓力：15 psi。β-受體激動劑質(zhì)譜參數(shù)見表3。

3.1結(jié)果

3.1.1色譜柱的選擇

色譜柱的選擇是待測組分分離效果好壞的重要因素。因此我們對Thermo C8和Thermo C18色譜柱進(jìn)行了比較，β-受體激動劑在C8柱上保留效果較差，靈敏度低。實驗選用C18色譜柱，8.0 min實現(xiàn)了β-受體激動劑良好分離，且峰型尖銳，靈敏度高。

3.1.2線性范圍和檢出限

上機(jī)測試6個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，β-受體激動劑與內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示：在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.999，采取標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋的方法，以信噪比（S/N>3）作為最終檢出限，詳見表4，可以滿足豬肉中11種β-受體激動劑的測定。

3.1.3回收率和精密度

稱取已檢測過的陰性樣品，每6個樣品為1組共分為3組，分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，制成0.5μg/kg、1μg/kg和5μg/kg低中高三水平濃度，并按照2.3所述方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣測定并計算回收率和RSD，計算結(jié)果見表5。結(jié)果顯示：回收率在70.8%～92.0%，RSD在8.9%～15.2%，表明方法準(zhǔn)確，回收率較好，精密度良好[9]。

3.1.4樣品測定

分別在超市、農(nóng)貿(mào)市場隨機(jī)采購20批豬肉，在這20份樣品中隨機(jī)抽取5份樣品添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使其成為陽性樣品，分別采用本文闡述方法與GB 31658.22—2022《動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行樣品前處理，隨后上機(jī)測試結(jié)果進(jìn)行比較。實驗結(jié)果顯示采購的樣品中均未檢出β-受體激動劑，兩種方法測得的陽性樣品結(jié)果采用單因素方差分析，F(xiàn)值小于F臨界值，P值大于0.05，表明兩組數(shù)據(jù)差別不明顯，說明建立的方法可行[10]。

3.2討論

現(xiàn)行有效的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中提及的提取方法，大多是β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶恒溫水解樣品，振蕩時間長達(dá)16 h，耗時長，需要投入大量人力、物力和時間。本實驗對豬肉中β-受體激動劑的提取進(jìn)行了優(yōu)化，使用實驗所用提取方法，可以大大縮短提取時間，總體而言，可以滿足豬肉中β-受體激動劑快速篩查的需要。

【參考文獻(xiàn)】

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[9]實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測：GB/T 27404—2008.

[S].

[10]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：GB 31658.22—2022[S].

【作者簡介】

通訊作者：師忠義，男，1968年出生，工程師，學(xué)士，研究方向為食品和藥品分析。電子郵箱：2689502953@qq.com。

李鑫，男，1985年出生，副主任中藥師，碩士，研究方向為中藥學(xué)。

潘明迪，男，1987年出生，高級工程師，學(xué)士，研究方向為化學(xué)。

李雅靜，女，1970年出生，正高級工程師，學(xué)士，研究方向為預(yù)防醫(yī)學(xué)。

張磊，男，1981年出生，高級工程師，學(xué)士，研究方向為醫(yī)學(xué)檢驗。

（編輯：李鈺雙）