建立一種EGFR突變檢測的凸環(huán)引物熒光PCR新方法

黃銘珊費政芳金霆

建立一種EGFR突變檢測的凸環(huán)引物熒光PCR新方法

黃銘珊1費政芳2★金霆2

目的建立一種能快速、有效檢測EGFR突變的凸環(huán)引物熒光PCR新方法。方法同時用凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法對混有不同比例的EGFR突變型質(zhì)粒的樣本進(jìn)行對照檢測，以對比兩者靈敏度；采用兩種方法對93例肺癌組織的EGFR基因進(jìn)行熱突變位點E746-A750del和L858R的檢測，并統(tǒng)計其符合率。結(jié)果在93例肺癌組織的DNA中，凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法檢測到EGFR突變分別為29例（E746-A750del 15例，L858R 14例）和28例（E746-A750del 15例，L858R 13例），符合率達(dá)96.6%，且凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法能檢測出混有5%突變質(zhì)粒型的樣本，其靈敏度達(dá)5%，比Sanger測序法高。結(jié)論凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法比測序法更為簡便，且靈敏度更高，易于實現(xiàn)，2小時內(nèi)即可得出準(zhǔn)確結(jié)果。

EGFR；凸環(huán)引物熒光PCR方法；Sanger測序法

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，年發(fā)病率為35/10萬人，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌的80%。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，近年來出現(xiàn)了新的治療方法——靶向治療。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），例如靶向藥物吉非替尼和厄洛替尼，能夠抑制酪氨酸激酶域的ATP與酪氨酸激酶的結(jié)合，阻止了酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而阻止EGFR信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終對腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成起到了抑制的作用，并增加了腫瘤細(xì)胞的凋亡[1~3]。吉非替尼或厄洛替尼是EGFR突變的晚期NSCLC患者最優(yōu)的一線治療選擇[4]。在眾多臨床研究表明，EGFR-TKI并不是對所有NSCLC患者的療效都是一樣的。有研究表明,那些EGFR發(fā)生突變的患者，對EGFR-TKI有高度的敏感性[5~7]，如EGFR外顯子19和21的突變[8]。在我國，NSCLC患者EGFR基因突變率約為34%，其中90%以上都是發(fā)生在外顯子19的E746-A750del 突變和外顯子21的L858R突變上[9]。因此，建立快速檢測NSCLC腫瘤組織EGFR基因的19和21外顯子突變情況的方法對篩選出能受益于EGFR-TKI 治療的優(yōu)勢人群是有極大的幫助的，這對患者開展個體化靶向治療也有十分重要的意義。本文通過比較采用凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法兩種方法對93例肺癌組織進(jìn)行EGFR外顯子19和21檢測的一致性及其靈敏度，尋找一種簡便、快捷、可靠的方法來幫助NSCLC患者實行個體化治療。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集福州市第一醫(yī)院2010年至2012年間的NSCLC術(shù)后石蠟包埋標(biāo)本93例。其中男性患者65例（69.9%），女性患者28例（30.1%）。年齡范圍從40至70歲，男性患者50.3±19.6歲；女性患者52.4±8.7歲，標(biāo)本均為病理科存檔樣品。

1.2 主要儀器與試劑盒

1.2.1 主要儀器

7500實時熒光定量PCR儀，ABI 9700 PCR儀

1.2.2 主要試劑盒

Qiagen公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒

1.3 方法

1.3.1 石蠟標(biāo)本DNA提取

采用Qiagen公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒，按試劑盒說明書操作，提取基因組DNA，提取后放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計

利用Primer Express 3.0軟件分別為凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法設(shè)計EGFR外顯子19和21野生型引物探針和突變型引物探針。外顯子19的野生型引物為5'-AATTCCCGTCGCTTTTTTG-3'，突變型引物為5'-AATTCCCGTCGCTATTTTTTC-3'，下游引物為5'-GAAAAGGTGGGCCTGAGGT-3'，探針為5'-ATTAAGAGAAGCAACATCTC-3'。外顯子2 1的野生型引物為5'-TGTCAAGATCACAGATTTTTTTTT-3'，突變型引物5'-GTCAAGATCACAGATTTTTTTTG-3'，下游引物為5'-TCCCAAAGCAGCTCTGGCTC-3'，探針為5'-CCAAACTGCTGGGTGCGGA-3'。

1.3.3 凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法檢測

在凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法中，分別設(shè)計的野生型引物和突變型引物，每條引物在基因突變點區(qū)與相應(yīng)型別的模板匹配，但在突變點后，引入連續(xù)的4到5個T堿基，其與原序列并不匹配，從而形成一個凸環(huán)結(jié)構(gòu)，讓引物分成了兩部分。凸環(huán)結(jié)構(gòu)與模板結(jié)合力較弱，其3'端區(qū)域與模板相匹配時，引物可以發(fā)生延伸，將探針?biāo)猓尫艧晒鈭蟾婊鶊F(tuán)，從而產(chǎn)生熒光曲線。當(dāng)3'端區(qū)域與模板不匹配時，在凸環(huán)結(jié)構(gòu)的影響下，引物脫離DNA模板，不能延伸，PCR無法擴(kuò)增，沒有熒光曲線產(chǎn)生（見圖1）。

圖1 凸環(huán)引物的作用示意圖Figure 1 The diagram of the convex ring PCR primers

對同一樣本DNA，在7500實時熒光定量PCR儀上同時用野生型引物探針和突變型引物探針進(jìn)行熒光定量PCR，其起反應(yīng)條件為：50℃，2 min；95℃15 min以激活DNA聚合酶；94℃ 15 s，55℃ 1 min，循環(huán)45次，分析結(jié)果。對于一個樣本，若其只有野生型引物管有熒光曲線，則此樣本為野生型；若只有突變型引物管有熒光曲線，則此樣本為突變型；若野生型和突變型引物探針都有結(jié)果，則此樣本為混合型，既有野生型DNA，也有突變型DNA（見圖2）。

1.3.4 Sanger測序法檢測

在ABI 9700 PCR儀進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束以后，取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%~2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有目的條帶。如觀察到明顯的單一目的條帶，則可將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，再在3500xL Genetic Analyzer上進(jìn)行測序PCR，然后利用ABI公司Sequencing Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析。

1.4 兩種方法靈敏度的檢測

將EGFR野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒均稀釋至同一濃度2.5 ng/μL，兩者按不同比例（100%、50%、20%、10%、5%、2%、0%）混合，作為模板，分別用凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法進(jìn)行檢測。

1.5 兩種方法對93例NSCLC石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行檢測

同時使用凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法對93例NSCLC石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 兩種方法靈敏度的比較

在混有突變型基因的樣本中，凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法能檢測出混有突變型質(zhì)粒低至5%的樣本，即靈敏度達(dá)5%（見圖3），而Sanger測序法的靈敏度約為10%~20%。因此該方法比傳統(tǒng)的Sanger測序法的靈敏度更高。

2.2 凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法

在93例NSCLC組織標(biāo)本中，共檢測到EGFR突變29例。其中，EGFR 19外顯子突變—E746-A750del有15例；EGFR 21外顯子突變—L858R有14例。

2.3 Sanger測序法

在93例NSCLC組織標(biāo)本中，共檢測到EGFR突變28例。其中，EGFR 19外顯子突變—E746-A750del有15例；EGFR 21外顯子突變—L858R有13例（見圖4）。

2.4 兩種方法檢測結(jié)果比較

凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法的檢測結(jié)果如下（表1）。選用配對卡方檢驗做統(tǒng)計學(xué)處理，經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，P=0.87，兩種方法無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

圖2 判斷樣本的類型Figure 2 Judging the types of samples

圖3 凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法的靈敏度Figure 3 The sensitivity of convex ring primers fl uorescent PCR method

圖4 Sanger測序法的測序結(jié)果Figure 4 The sequencing results of Sanger sequencing method

表1 凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法的檢測結(jié)果Table 1 The detective results of convex ring primers fl uorescent PCR method and Sanger sequencing method

肺癌，作為中國發(fā)生率和死亡率最高的癌癥，已嚴(yán)重危害到廣大人民的生命健康。其中，NSCLC占肺癌的80%，為了更有效的治療，更低的毒副作用，讓患者得到個體化治療，選擇對具有肺癌細(xì)胞特異的分子靶點進(jìn)行治療是大勢所趨。而目前國內(nèi)外研究者所公認(rèn)的一個腫瘤靶向治療分子就是EGFR[10]，且EGFR基因突變的NSCLC患者對EGFR-TKI的有效率明顯高于未選擇的NSCLC患者[11]，所以對EGFR的研究具有重大的意義。隨著科技的發(fā)展，腫瘤靶向治療的方向，個體化治療的重要標(biāo)志，應(yīng)該運用恰當(dāng)?shù)陌悬c，利用合適的藥物，治療特定的人群[12]。

直接測序法是對EGFR突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[13,14]，但其靈敏度不高，難以對突變頻率低的標(biāo)本進(jìn)行檢測。本文在對93例肺癌患者的EGFR外顯子19上的熱點突變E746-A750del和外顯子21上的熱點突變L858R的檢測中，用凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測序法進(jìn)行了對比。兩者達(dá)到96.6%的符合率，特異度和準(zhǔn)確度都達(dá)98%以上。且用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩種方法檢測EGFR基因突變率比較采用配對卡方檢驗做統(tǒng)計學(xué)處理，經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，P=0.87，兩種方法無統(tǒng)計學(xué)差異。在外顯子19的E746-A750del突變上，凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法比Sanger測序法多檢測出突變樣品。可能因該方法比測序法更靈敏，能檢測出突變含量低的臨床樣品，但仍需進(jìn)一步驗證。

從靈敏度上來看，凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法更有優(yōu)勢，能檢測出低至混有5%突變型質(zhì)粒的樣本，靈敏度達(dá)5%，而Sanger測序法只能達(dá)到10%~20%。再從樣本檢測通量和速度上來看，凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法采用96個孔板的實時熒光PCR儀，可同時進(jìn)行四十多個樣本，且在2個小時內(nèi)能得出結(jié)果。而Sanger測序法還需要經(jīng)過純化等步驟，操作繁瑣，耗時較長，容易在中間環(huán)節(jié)出差錯，不如凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法簡單、方便。

綜上所述，本文新建立的凸環(huán)引物熒光PCR技術(shù)法，具有簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點，能應(yīng)用到NSCLC患者EGFR外顯子19和21的突變情況的檢測上，讓患者真正能實行個體化治療。

[1] Costa D B, Nguyen K S, Cho B C, et al. Effects of erlotinib in EGFR mutated non-small cell lung cancers with resistance to gef i tinib[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(21): 7060-7067.

[2] Sibilia M, Kroismayr R, Lichtenberger B M, et al. The epidermal growth factor receptor: from development to tumorigenesis[J]. Differentiation, 2007, 75(9): 770-787.

[3] Wheeler D L, Dunn E F, Harari P M. Understanding resistance to EGFR inhibitors-impact on future treatment strategies[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2010, 7(9): 493-507.

[4] Zhou C, Wu Y L, Chen G, et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer(OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, openlabel, randomised, phase 3 study[J]. Lancet Oncol, 2011, 12(8): 735-742.

[5] Yasumatsu R, Nakashima T, Uryu H, et al. Correlations between thymidylate synthase expression and chemosensitivity to 5-fluorouracil, cell proliferation and clinical outcome in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Chemotherapy, 2009, 55(1): 36-41.

[6] Lynch T J, Bell D W, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gef i tinib[J]. N Engl J Med, 2004, 350(21): 2129-2139.

[7] Mok T S, Wu Y L, Thongprasert S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J]. N Engl J Med, 2009, 361(10): 947-957.

[8] Zhu J Q, Zhong W Z, Zhang G C, et al. Better survival with EGFR exon 19 than exon 21 mutations in gefitinib-treated non-small cell lung cancer patients is due to differential inhibition of downstream signals[J]. Cancer Lett, 2008, 265(2): 307-317.

[9] 董強(qiáng)剛, 黃進(jìn)肅, 黃建, 等. 肺癌靶向治療研究與我國肺癌的EGFR基因突變概況[J]. 腫瘤, 2005, 25(6): 625-628.

[10] 婁加陶, 吳傳勇, 薛劍, 等. 基于懸浮點陣技術(shù)的新型EGFR基因突變檢測方法的建立和應(yīng)用[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報, 2011, 31(3): 284-286.

[11] Paez J G, J?nne P A, Lee J C, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[J]. Science, 2004, 304(5676): 1497-1500.

[12] Camidge D R, Hirsch F R, Varalla-Garcia M, et al. Finding ALK-positive lung cancer. what are we really looking for[J]. J Thorac Oncol, 2011, 6(3): 411-413.

[13] Zhou C C, Zhou S W, Pan H, et al. Detection of epidermal growth factor receptor mutations in non-small cell lung cancer by real-time PCR using TaqMan-MGB probes[J]. Chin J Clin Oncol, 2007, 29(2): 119-123.

[14] Li Y W, Liu H, Li Y, et al. EGFR mutations detection in non-small cell Lung cancer tissues by real-time PCR and DNA sequencing[J]. Chin J Lung Cancer, 2009, 12(12): 1255-1259.

Establish a new convex ring primer fluorescence PCR method to detect EGFR mutation

HUANG Mingshan1, FEI Zhengfang2★, JIN Ting2
(1.Fujian Health College, Fujian, Fuzhou 350101, China; 2.The First Hospital of Fuzhou, Fujian, Fuzhou 350004, China)

Objective To establish a rapid and effective convex ring primer fl uorescence PCR to detect EGFR gene mutation. Methods The samples mixed with different proportion of EGFR mutant plasmid were detected by convex ring primers fl uorescent PCR method and Sanger sequencing method, respectively, and compare their sensitivity. Hot mutation sites E746-A750del and L858R of EGFR gene were detected in 93 cases of lung cancer tissue, and the coincidence rate were calculated. Results In 93 cases of lung cancer tissue, the convex ring primer fl uorescence PCR method and Sanger sequencing method detection to EGFR mutations were 29 cases (E746-A750del 15 cases, L858R 14 cases) and 28 cases (E746-A750del 15 cases, L858R13 cases), respectively. The coincidence rate was 96.6%. The convex ring primers fl uorescent PCR method could detect the samples mixed with 5% EGFR mutant plasmid, which sensitivity was 5% and higher than Sanger sequencing method. Conclusion The convex ring primers fl uorescent PCR method was more sample, sensitivity and easy to realize than Sanger sequencing method, and also could get the accurate results within two hours.

EGFR; Convex ring primers fluorescent PCR method; Sanger sequencing method

1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建，福州 350101 2.福州市第一醫(yī)院，福建，福州 350004

★通訊作者：費政芳，E-mail：fzf776@163.com