叢枝菌根真菌對低磷脅迫下核桃幼苗根系磷吸收的影響及機制*

曹明奡 張 菲 黃光明 劉瑞成 劉利平 吳強盛 徐永杰

（1.長江大學園藝園林學院/西藏高原核桃產業研究所 荊州 434025；2.黃岡師范學院 經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室 黃岡 438000；3.湖北省林業科學研究院 武漢 430075）

磷（P）是植物生長發育不可缺少的營養元素之一，不僅參與光合作用、核苷酸合成、信號轉導以及能量傳遞等多種代謝過程，還是蛋白質和脂質等生物大分子的重要組成部分。土壤中20%～80%的P 以有機形態存在，這些有機P 很難被植物根系直接吸收，必須被磷酸酶轉化（Shaoet al.，2021）。此外，土壤速效P也容易被土壤中的鐵和鋁等固定，導致土壤P 不足，是作物產量的主要限制因素之一（Izabelaet al.，2019）。施P 肥可補充土壤P 不足，然而P 肥會消耗不可再生的磷礦儲量，如何提高植物對P 的吸收是農林業生產需要解決的一個重要課題。

核桃（Juglans regia）為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）多年生落葉喬木，既是優質的用材樹種，也是營養豐富的食用干果樹種和珍貴的油料樹種。P是核桃生長發育必需的營養素之一，特別是果實的產量和品質直接受土壤和核桃植株P 含量的影響（Yuet al.，2011）。然而，核桃園土壤肥力普遍偏低，特別是有效P 含量，導致核桃果實產量不高，油脂含量低（張翠萍，2014）。核桃根際存在某些有益的叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌，這些AM 真菌能夠侵入核桃根系建立叢枝菌根共生體（Liet al.，2021）。研究表明，AM 真菌[如摩西球囊霉（Glomus mosseae）和根內球囊霉（G.intraradices）]接種在核桃組培苗上可顯著提高移栽成活率（Dolcet-Sanjuanet al.，1996）。Huang 等（2020）在‘遼河一號’核桃（J.regiacv.Liaohe 1）上接種5 種AM 真菌 [細凹無梗囊霉（Acaulospora scrobiculata）、沾屑多樣孢囊霉（Diversisporaspurca）、幼套球囊霉（G.etunicatum）、摩西球囊霉（G.mosseae）和地表球囊霉（G.versiforme）] 后發現植株生長明顯改善，其中沾屑多樣孢囊霉促進效果明顯。Cheng 等（2020）研究發現，接種AM 真菌可提高'遼河一號'核桃葉片的P、K、Mg、B、Fe、Zn 和Cu 含量。在正常水分和干旱脅迫條件下，摩西球囊霉、幼套球囊霉及二者混合物均可增加核桃葉片的N、P 和Zn 含量（Behroozet al.，2019）。已有研究表明，AM 真菌通過根外菌絲網絡從根系無法接觸的土壤區域將無機磷酸鹽轉運到宿主植物，并通過AM 真菌高親和力的磷轉運基因（如RiPT7）、向根際分泌磷酸酶以及上調宿主根系磷轉運基因表達水平，促進宿主P 的吸收（Zuccaro，2019;Shaoet al.，2021; Xieet al.，2022）。目前，AM 真菌是否并如何通過磷轉運基因調控根際磷酸酶活性促進核桃根系P 吸收尚不清楚。鑒于此，本研究采用低P 脅迫處理核桃幼苗并接種AM 真菌，探索低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系 P 吸收的影響及機制，以期為核桃幼苗的栽培生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用2×2 雙因素試驗設計。因素一為沾屑多樣孢囊霉接種和不接種處理；因素二為P 處理，包括適P（100 μmol·L-1）和低P（1 μmol·L-1）。試驗共4 個處理，每處理重復8 次，共32 盆，每盆定植1 株核桃幼苗，隨機排列。

1.2 試驗處理

以‘遼河一號’核桃為材料，其種子由湖北省保康縣核桃技術推廣中心提供。種子預先用體積分數75%的乙醇表面消毒，滅菌水潤洗后，播種于經高溫高壓（121℃，0.11 MPa，2 h）滅菌的河沙中，在晝夜溫度28 ℃ /20 ℃、相對濕度80% 的培養箱內催芽。待長出4 片真葉后移栽至塑料盆（2.4 L）中，盆栽基質為河沙。為防止基質中原有P 元素對試驗的干擾，使用前先經酸洗脫并用蒸餾水洗凈，后在高溫、高壓（121 ℃，0.11 MPa）下滅菌2 h。

基于前期篩選的1 個高效AM 真菌菌株——沾屑多孢囊霉（Huanget al.，2020；Chenget al.，2020），移栽時進行沾屑多孢囊霉的接種。該菌種保存于長江大學根系生物學研究所，經白三葉（Trifolium repens）擴繁3 個月后，收獲被AM 真菌侵染的根段（菌根侵染率在95%以上）與含AM 真菌的栽培基質（孢子密度為15 個·g-1）作為菌劑。接種AM 真菌處理的植株每盆施入120 g 菌劑，不接種處理施入等量滅菌的菌劑，并添加等量菌劑的過濾滅菌液2 mL 以保持除目的菌種以外的微生物區系一致性。接種1 周后，進行P 脅迫處理。通過控制Hoagland 營養液（pH7.0）中的KH2PO4濃度調節盆栽基質P 濃度，其中100 μmol·L-1KH2PO4為適P 處理（李永夫等，2010），1 μmol·L-1KH2PO4為低P 處理。每盆、每3 天加營養液150 mL。此外，營養液澆灌每3 次后的次日以100 mL 重蒸水施入以洗去基質殘留的營養液，防止P 積累。所有處理的核桃苗置于長江大學的塑料溫室中進行苗木培養，3 個月后收獲植物和土壤材料。

1.3 指標測定

收獲時將植株分成地上部分和地下部分，測定各自的鮮質量。

根系菌根侵染判斷依據Phillips 等（1970）方法。利用卷尺測量主根長度，使用Epson 掃描儀對根系進行掃描，應用WinRHIZO 2007 軟件分析根系形態參數。運用ICP 光譜儀測量根系P 含量。根系酸性磷酸酶活性采用對硝基苯酚磷酸二鈉比色法（Mclachlanet al.，1987）測定。土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉法（趙蘭坡等，1986）測定。

通過NCBI 數據庫獲取擬南芥紫色酸性磷酸酶分泌基因（AtPAP10和AtPAP12，可水解有機磷）和磷轉運基因（AtPT3;1和AtPT3;3，可促進植物在缺P 條件下對P 的吸收）序列。經過核桃基因組數據庫（http://aegilops.wheat.ucdavis.edu/Walnut/data.php）比對分析，使用Primer Premier 5.0 軟件設計JrPAP10、JrPAP12、JrPT3;1、JrPT3;3基因引物序列（表1），由上海生物工程有限公司合成。根樣總RNA 采用植物專用RNA提取試劑盒(Aidlab) 進行，然后利用反轉錄試劑盒（Takara）進行RNA 反轉錄。以反轉錄的cDNA 為模板，以核桃的18S rRNA作為內參基因進行qRT-PCR擴增。實時熒光定量表達分析采用熒光染料法進行，每處理3 個生物學重復。采用2-ΔΔCt方法（Livaket al.，2001）計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR 中的基因引物序列Tab.1 The primer sequence of genes in qRT-PCR

1.4 統計分析

采用SAS 軟件的GLM 過程進行雙因素（沾屑多樣孢囊霉接種和P 處理）方差分析，應用鄧肯多重比較法分析（P＜ 0.05），使用SAS 軟件分析皮爾遜相關系數。

2 結果與分析

2.1 根系菌根侵染

未接種AM 真菌的核桃根系未觀察到任何菌根結構，接種沾屑多樣孢囊霉處理的核桃幼苗根系發現菌根侵染（圖1）。接種沾屑多孢囊霉的植株在低P（1 μmol·L-1）和適P（100 μmol·L-1）條件下根系菌根侵染率分別為53.2%±3.6% 和45.6%±4.9%（均值±SD），且低P 處理顯著提高根系菌根侵染率。

圖1 核桃根系被沾屑多孢囊霉侵染Fig.1 Root colonization of walnut by D.spurca

2.2 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗生長的影響

與適P 處理相比，低P 脅迫顯著降低地上部、地下部及總生物量（表2）。此外，在低P 和適P 條件下，接種AM 真菌均顯著提高植物地上部、地下部及總生物量，低P 下分別提高56%、52%、51%，適P 下分別提高56%、27%、27%。交互作用結果顯示，AM 真菌處理和P 處理均顯著提高生物量，但二者間沒有顯著的交互作用。

表2 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃幼苗生物量的影響①Tab.2 Effects of D.spurca on biomass of walnuts seedlings under low P stress

2.3 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系形態的影響

在適P 條件下，接種AM 真菌提高根系體積48%，降低根平均直徑12%，對總長、投影面積以及表面積無顯著影響（表3）。在低P 條件下，接種AM 真菌顯著提高根系總長、投影面積、表面積、平均直徑和體積，分別提高21%、27%、28%、29% 和45%。AM 真菌接種顯著影響根系總長、表面積和體積，P 處理對根系形態沒有影響，AM 真菌和P 對根系投影面積和平均直徑存在顯著交互作用。

表3 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃幼苗根系形態的影響①Tab.3 Effects of D.spurca on root morphology of walnut seedlings under low P stress

2.4 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系P 含量和酸性磷酸酶活性的影響

未接種AM 真菌條件下，低P 處理顯著降低根系P 含量65%；接種AM 真菌條件下，低P 處理降低根系P 含量11%（圖2A）。此外，低P 脅迫下接種AM 真菌顯著增加根系P 含量51%，適P 條件下接種AM 真菌對根系P 含量無顯著影響。P 脅迫僅對菌根化植株根系酸性磷酸酶活性有促進效應。適P 條件下，AM真菌接種對根系酸性磷酸酶活性沒有顯著影響；低P條件下，AM 真菌接種顯著地提高根系酸性磷酸酶活性11%（圖2B）。交互作用分析顯示，單一AM 真菌處理和P 處理均顯著影響了系P 含量和根系酸性磷酸酶活性，且兩因素僅顯著交互影響根系P 含量（表4）。

圖2 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃幼苗根系磷含量（A）和酸性磷酸酶活性（B）的影響Fig.2 Effects of D.spurca on root P content (a) and acid phosphatase activity (b) of walnut seedlings under low P stress

表4 AM 真菌處理（A）和P 處理（P）間變量的交互作用顯著性Tab.4 Variable significance of the interaction between AM fungal inoculation (A) and P treatments (P)

2.5 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗土壤磷酸酶活性的影響

與適P 處理相比，低P 處理僅抑制非菌根化植株土壤堿性磷酸酶活性，對土壤酸性和中性磷酸酶無顯著影響（圖3）。相反，在菌根化植株上，低P 處理提高土壤酸性和中性磷酸酶活性，但降低堿性磷酸酶活性。另一方面，在低P 和適P 條件下，接種AM 真菌均對土壤酸性、中性和堿性磷酸酶活性有顯著提高作用（圖3），分別在低P 下提高47%、220%、164%以及適P 下提高15%、66%、162%。AM 真菌和P 處理顯著交互影響土壤各磷酸酶活性（表4）。由此可見，低P狀態下，AM 真菌對土壤酸性和中性磷酸酶活性的提升效果明顯高于適P 條件，這表明AM 真菌在P 缺乏條件下更能促進土壤酸性和中性磷酸酶活性。

圖3 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃土壤磷酸酶活性的影響Fig.3 Effects of D.spurca on soil phosphatase activity of walnuts under low P stress

2.6 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系酸性磷酸酶分泌基因和磷轉運基因表達量的影響

低P 和適P 處理下接種AM 真菌， 均根系JrPAP10的相對表達量分別提高1 570% 和96%（P＜0.05）（圖4A）。低P 脅迫下接種AM 真菌，根系JrPAP12的相對表達量提高35%（P＜0.05），適P 處理時接種AM 真菌對根系JrPAP12的相對表達量無顯著影響。此外，低P 和適P 條件下接種AM 真菌，根系JrPT3;1的相對表達量分別提高354% 和83%（P＜0.05）（圖4B）。低P 脅迫下接種AM 真菌，根系JrPT3;2的表達量降低45%，但對適P 條件下根系JrPT3;2的表達量無顯著影響。AM 真菌和P 處理均顯著交互影響根系JrPT3;1、JrPT3;1、JrPAP10和JrPAP12的表達水平（表4）。

圖4 P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃根系酸性磷酸酶分泌基因(a)和磷轉運蛋白基因(b)表達量的影響Fig.4 Effect of D.spurca on the relative expression of acid phosphatase secretion genes (a) and phosphate transporter protein genes (b) of walnut roots under P stress

2.7 相關性分析

根系P 與土壤堿性磷酸酶活性、根系JrPAP12相對表達量、根系投影面積、根系表面積以及根平均直徑呈顯著正相關（P＜ 0.05），與根系JrPT3;2相對表達量呈極顯著負相關（P＜ 0.01）（表5）。菌根侵染率與土壤酸性、中性、堿性磷酸酶、根表面積、體積以及根系JrPT3;1 和JrPAP10的相對表達量呈極顯著正相關，與根總長呈顯著正相關。

表5 核桃根系磷含量與相關變量的相關性①Tab.5 Relationship between P content and relevant variables of walnut roots

3 討論

沾屑多孢囊霉可與‘遼河一號’核桃根系建立菌根共生體，且低P 處理促進根系菌根侵染率，與黃京華等（2006）研究玉米（Zea mays）幼苗在低P 脅迫菌根侵染率升高一致。AM 真菌侵染率往往與宿主根際基質P 含量呈負相關，低P 狀態刺激菌絲的長度及菌根的形成（Wuet al.，2015）。本研究中，低P 處理顯著降低核桃幼苗生物量，但接種AM 真菌在不同程度緩解低P 脅迫對核桃幼苗生物量的抑制影響，且在低P 條件下菌根促進生長作用要高于適P 條件下，說明菌根的作用在低P 條件下更突出（黃京華等，2006）。

根系是植物的重要吸收器官，也是土壤與植物的動態界面，根系的生長和形態構建與環境中養分的供應和利用率密切相關，且具有很大可塑性，能被AM真菌調控（Liuet al.，2021）。本研究發現，適P 條件下接種AM 真菌僅顯著提高根系體積，而低P 條件下接種AM 真菌顯著提高根系總長、投影面積、表面積、平均直徑和體積，從而導致菌根化的植株能接觸到更多的土壤區域，進而有利于植物對P 的吸收，與Shao等（2021）在低P 脅迫下茶樹（Camellia sinensis）上接種幼套球囊霉提高根系形態的結果一致。接種AM 真菌能顯著改善核桃根系構型且在低P 條件下響應更強烈。此外，根系P 含量與根系投影面積、表面積以及平均直徑呈顯著正相關，AM 真菌改善根系構型是影響植物吸收P 的重要原因（Zhanget al.，2018a）。

土壤有機P 是土壤全P 的重要組成部分，占20%～50%，需在土壤磷酸酶的作用下轉化為無機P后才能被根系吸收（Zuccaro，2019）。本研究發現，接種AM 真菌對低P 和適P 條件下土壤酸性、中性和堿性磷酸酶活性均顯著提升，與Yang 等（2021）在枳（Poncirus trifoliata）實生苗上接種摩西管柄囊霉提高土壤酸性、中性和堿性磷酸酶活性的結果一致，且低P 狀態下接種AM 真菌對土壤磷酸酶活性的提升更明顯。植物在低P 條件下生長受抑制，菌根通過增加植物向根系分泌磷酸酶，從而促進植物P 的吸收（Smithet al.，2003）。此外，AM 真菌在根外菌絲招募溶磷細菌并促進其分泌磷酸酶，有利于土壤有機磷的礦化（Jianget al.，2021；Zhanget al.，2018b； 2018c）。本研究顯示，菌根侵染率與土壤酸性、中性和堿性磷酸酶均呈極顯著正相關，表明菌根促進土壤堿性磷酸酶活性的提升而顯著影響根系P 含量。另一方面，低P 處理下接種AM 真菌可提高核桃根系酸性磷酸酶活性。已知菌根菌絲、液泡和叢枝中包含酸性磷酸酶（Aarleet al.，2010），低P 條件比適P 條件顯著促進沾屑多孢囊霉對核桃根系的侵染，說明菌根侵染率的增加可能促進根系磷酸酶的活性，并加快向根際釋放。酸性磷酸酶能催化多聚磷酸鹽分解（Tatsuhiroet al.，2010），從而促進植物對P 的吸收。

本研究表明，低P 處理下接種AM 真菌顯著誘導根系JrPAP10和JrPAP12的表達（尤其是JrPAP10），與舒波（2013）的研究結果一致。相關性分析表明，根系JrPAP10與根系菌根侵染率和根系酸性磷酸酶活性（r= 0.72,P＜ 0.01）均呈極顯著正相關，表明低P 條件下AM 真菌促進根系酸性磷酸酶活性與AM 真菌誘導根系JrPAP10表達有關。此外，根系P 含量與JrPAP12表達量呈顯著正相關。因此，菌根可以通過間接地對酸性磷酸酶基因的表達產生影響，進而改善植物P 的吸收功能。

AM 真菌能促進植物對P 的吸收，尤其在土壤營養匱乏的環境中，菌根菌絲對P 的傳遞作用更顯著（薛英龍等，2019）。本研究表明，低P 脅迫顯著降低根系P 含量，且只有在低P 條件下AM 真菌才顯著提高核桃根系P 含量，適P 條件下則無顯著影響。適P條件下植物根系能吸收到足夠的P，因此菌根的作用不顯著；而低P 條件下，植物吸收不到足夠的P，需在AM 真菌的幫助下增強土壤磷酸酶活性，促進土壤有機磷水解，且其菌絲能伸展到根系不能到達的區域攝取額外的P 以滿足植物對P 的需求（Zuccaro，2019）。

AM 真菌通過誘導植株根系的高親和力磷轉運基因高效表達，增強植物對P 的吸收并轉移到相應的部位（薛英龍等，2019）。本研究表明，低P 和適P 條件下AM 真菌均上調根系JrPT3;1的相對表達量，且菌根侵染率與JrPT3;1極顯著正相關，與劉春艷等（2017）在低P 脅迫下接種摩西管柄囊霉誘導枳根系PtaPT3、PtaPT5和PtaPT6表達的研究結果一致。然而，低P條件下AM 真菌卻抑制根系JrPT3;2的相對表達量，根系P 含量與根系JrPT3;2的相對表達量呈極顯著負相關，可能JrPT3;2是一個低親和力的磷轉運基因，而菌根能夠特異地誘導某些高親和力磷轉運基因如玉米ZmPT9的表達水平（Rauschet al.，2001; Xuet al.，2018）。本研究中，JrPT3;1在低P 條件下被沾屑多孢囊霉誘導，增加354%，因此，JrPT3;1是否是一個沾屑多孢囊霉特異誘導的磷轉運基因，JrPT3;1在含有叢枝的根系皮層細胞中的功能，還待深入研究。

4 結論

低P 脅迫抑制核桃幼苗根系發育，降低生物量、根系P 含量、土壤堿性磷酸酶活性以及JrPAP12的表達。而在低磷脅迫下接種AM 真菌誘導JrPAP10、JrPAP12和JrPT3;1基因的表達，促進土壤以及根系磷酸酶活性，改變根系構型，從而提高植物P 吸收和生物量積累，但AM 真菌接種在適P 條件下并沒有在低P 條件下對核桃幼苗根系P 含量改善顯著。因此，在生產實踐中，可在土壤相對貧瘠的核桃園引入AM真菌或者核桃育苗過程中接種AM 真菌，培育菌根化核桃苗，用于各種土壤的定植。