干化對粗枝云杉體胚解剖結構及細胞壁重塑基因表達的影響

凌娟娟，胡繼文，王軍輝，安三平，王麗芳，許 娜，朱天擎

(1.中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，國家林木種質資源平臺，北京 100091；2.林木遺傳育種全國重點實驗室，中國林業科學研究院，北京 100091；3.甘肅省小隴山林業科學研究所，甘肅省次生林培育重點實驗室，甘肅 天水 741022)

體細胞胚胎發生（體胚發生）是規?；庇帜玖挤N的一項重要技術，相較其他無性繁殖方式，體胚發生具有徹底幼化、繁殖數量大及速度快等優點，至今已被廣泛應用于云杉優良無性系繁育中。云杉（Picea asperataMast.）是構成低緯度高海拔群落的主要針葉樹種，在陸地生態系統中占有重要生態地位。此外，云杉具有單位面積蓄積量高，木質纖維長而柔軟的特點，是高產優質的建筑及紙漿材原料。然而在實際生產中，云杉體胚的快繁技術仍面臨萌發率和轉換率低的問題。因此，解決云杉體胚萌發率低，實現高效的云杉規模化繁育體系對生態文明建設及木材可持續利用均具有重要意義。

植物體胚與合子胚均具有轉變為完整植株的能力。通常合子胚，即種子發育的最后會經歷成熟脫水階段，獲得脫水耐受性，提高萌發能力[1]。例如苜蓿（Medicago sativaL.）種子從果實中分離需處于成熟脫水階段才能萌發[2]，表明了脫水過程對于胚萌發的重要性。以合子胚獲得脫水耐受性可提高萌發能力為參考，早期研究發現將云杉體胚置于干燥或高滲透壓條件下，降低其含水量能夠有效提高體胚萌發率，該方法被稱為干化[3-5]。干化對體胚的整體外觀和微觀形態都有著顯著影響，整體觀察，干化能使云杉體胚顏色發生改變，根據色素沉積的多少可將干化體胚分為綠色子葉胚（胚根為紅色，胚軸和子葉為綠色）和非綠色子葉胚（胚根、胚軸和子葉與干化前變化不大）兩類。其中綠色子葉胚的萌發率要遠遠高于非綠色子葉胚，這種表型差異也被用以簡單快捷地判斷干化是否成功[6-7]。此外，可以觀察到云杉體胚表層在干化后呈皺縮狀[8]，暗示了在干化過程中體胚細胞結構的變化。有研究表明，當裸子植物合子胚經歷脫水時，細胞收縮產生的張力可能導致干燥敏感的細胞受到不可逆的損傷，但細胞壁折疊在整個脫水過程中能保持質膜和細胞壁的連接，從而確保細胞完整性[9-10]。這也是植物在生長發育過程中依賴改變細胞壁構象來應對各種環境刺激的機制。體胚和合子胚高度相似，如白云杉成熟體胚，其形態上除了胚的大小、子葉的取向和表面起皺等方面與合子胚存在一定差異外，其總體形態與發育階段一致的合子胚非常相似[8]。然而，至今還沒有可靠的科學證據表明細胞壁構型的動態變化是云杉體胚響應干化的一種模式。最近關于挪威云杉干化體胚解剖觀察的研究顯示，干化后體胚解剖結構變化顯著，表現為細胞積累大量的脂質體和顯著降低的淀粉粒[7]，然而限于顯微結構放大倍數的，該研究并未觀察到干化細胞明顯的細胞壁結構變化。

綜合早期研究的證據，本課題組認為干化后云杉體胚特定的解剖結構，特別是細胞壁的可塑性可能是萌發率提高的原因之一。為了證實這一假設，本研究通過光學顯微和電子顯微觀察精準地分析干化對體胚解剖結構的影響，建立了細胞形態變化與萌發的關系，同時分析了干化體胚子葉和胚根的差異表達轉錄本，旨在揭示干化影響粗枝云杉的關鍵表型和基因表達模式，最終為全面解析干化促進體胚萌發的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料與試驗設計

本研究以實驗室保存的粗枝云杉（Picea asperataMast.）胚性細胞系a 為材料進行云杉體胚發生，再以誘導形成的體胚進一步開展關于干化促進體胚萌發的研究。將繼代培養14 d 的高胚性細胞系a 組織團塊接種至裝有80 mL 液體增殖培養基（調整過的Litvay 基本培養基[11]+ 10 μmol·L-12,4-D + 5 μmol·L-16-BA + 10 g·L-1蔗糖 + 1 g·L-1酶解酪蛋白，培養基冷卻至室溫時加入過濾滅菌的谷氨酰胺至終濃度為0.5 g·L-1）中，23 ± 1 ℃，110 rpm 震蕩暗培養，每7 d 繼代一次。將獲得的胚性組織接種至分化培養基（1/2 LM + 26 mg·L-1ABA + 50 g·L-1PEG4000 + 30 g·L-1蔗糖 + 活性炭1 g·L-1+ 凝膠4 g·L-1，附加1 g·L-1水解酪蛋白，0.5 g·L-1過濾滅菌的谷氨酰胺）上誘導獲得成熟的體細胞胚。具體步驟為：用吸頭剪口的移液器吸取4 mL 左右的懸浮培養液到裝有定性濾紙（Whatman）的布氏漏斗上，使用真空泵真空抽濾，得到吸附有胚性組織的濾紙。將濾紙轉接到固體分化培養基上。于23 ± 1 ℃ 下暗培養6～8 周。挑選形態基本一致的成熟子葉胚，采用“濾紙法”[6]進行干化處理。具體步驟為：將發育完全的體胚置于鋪有兩層濾紙的培養皿（35 mm × 12 mm）上，隨后將培養皿置于大規格培養皿（87 mm ×15 mm）內，大培養皿中加入10 mL 無菌水，用封口膜密封，最后置于15 μmol·m-2·s-1的弱光下培養。

1.2 研究方法

1.2.1 體胚萌發狀況和萌發率統計 將干化處理1、7、9、12、14、20 和28 d 后的體胚分別接種至萌發培養基（1/2 LM + 20 g·L-1蔗糖 + 2 g·L-1活性炭，附加6 g·L-1凝膠，1 g·L-1酶解酪蛋白，0.5 g·L-1過濾滅菌的谷氨酰胺）上進行萌發，萌發條件設置為16 h 光照，18～20 μmol·m-2·s-1光照強度，24 ± 1 ℃。通過目測統計每份培養皿中體胚的生根情況，以根系分化露白為萌發指標，計算萌發體胚占總體胚數的比例，以此作為體胚的萌發率，每個處理統計3 個重復，每個重復統計約50個體胚。使用超景深3D 顯微鏡DVM6A（Leica，Germany）觀察干化0、1、7、9 和14 d 的體胚形態。

1.2.2 掃描電鏡樣品制備 （1）將未干化和干化14 d 的體胚對半切開，置于10 倍樣品體積的0.1 mol·L-1PB（pH7.2～7.4） 配制的 2.5%的戊二醛固定液（4 ℃預冷）中，抽真空兩次，每次10 min（第一次抽完之后，樣品沉底，將浮在上面的樣品棄掉），更換固定液4 ℃避光固定48 h。（2）使用PB 緩沖液沖洗兩次，每次15 min。（3）梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）4 ℃條件下脫水，每次15 min。（4）使用全自動臨界點干燥儀（Leica EM CPD300，USA）進行臨界點干燥。（5）使用高真空鍍膜機（Leica EM ACE600，USA）鍍鉑金4 nm。（6）樣品置于高新場發射掃描電子顯微鏡（日立SU8230，Japan）下觀察體胚的超微結構。

1.2.3 半薄切片制作和顯微觀察 （1）將體胚切成小塊，放入2.5%戊二醛固定液中，0～4 ℃固定3 h 以上；經0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液清洗3 次，丙酮逐級脫水，Epon 樹脂浸透包埋；最后在60 ℃烘箱中聚合。（2）通過超薄切片機（Lecia EM U7，Germany）切取1～2 μm 左右的切片。（3）然后將切片置于烤片機上45 ℃烤片，隨后使用甲苯胺藍染液進行染色，隨后用50%乙醇沖洗，并再次把切片烘干。切片樣品在光學顯微鏡（Olympus BX51，Japan）下進行觀察。

1.2.4 透射電鏡樣品制備和觀察 （1）將0.5～1 mm 見方的樣品塊置于0.1 mol·L-1PB（pH7.2～7.4） 配制的 2.5% 的戊二醛固定液（4 ℃預冷）中固定（與掃描電鏡觀察所用樣品固定方法一致）。（2）PB 緩沖液清洗4～8 遍，每次0.5～1 h。（3）1%鋨酸4 ℃避光固定2～8 h，雙蒸水清洗4 遍，每次15～30 min。（4）2%UA，2 h 避光，更換新的2 mL 管，雙蒸水清洗4 遍，每次20 min，用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色。（5）44 ℃條件下梯度乙醇逐級脫水。（6）室溫下乙醇梯度脫水。（7）丙酮樹脂逐級滲透。（8）將樣品轉移至500 μL 管，將切面與管底部平行，45 ℃放置2 h，再60 ℃，靜置24～48 h。（9）用鉆石刀在超薄切片機下切片，制作好的切片置于透射電鏡下（HITACHI HT-7700, Japan）觀察。

1.2.5 轉錄組數據分析 轉錄組數據來自課題組之前的研究基礎，詳細數據存入PICEAdatabase（http://www.piceadb.com/）[12]。本研究利用干化處理14 d 和未處理的體胚子葉和胚根的測序數據進行后續分析。將readcount 數據上傳到OmicShare Tools 平臺（https://www.omicshare.com），使用DEseq2 工具來進行差異分析，差異基因必須滿足以下條件: 差異倍數fold change（FC）≥ 2, 顯著性值Q value ＜ 0.05。

1.2.6 數據分析和圖表制作 采用SPSS 22.0 統計軟件進行單因素方差分析和Duncan 法多重比較。使用GraphPad Prism 8 和 Adobe Illustrator CS6 軟件生成圖形。

2 結果與分析

2.1 粗枝云杉體細胞胚的分化、干化和萌發

本研究所采用的粗枝云杉體胚由胚性組織（圖1 a）分化而來，詳細的分化過程如圖1 所示。將胚性組織置于分化培養基上培養，隨著培養天數的增加體胚的形態逐漸顯現（圖1 b），數量逐步增加。未成熟子葉胚的胚根處呈半透明狀，子葉未完全形成（圖1 c）。大約分化50 d 后會形成大量的成熟子葉胚（圖1 d），成熟子葉胚具有完整的子葉和胚根（圖1 e）。

分化形成的成熟子葉胚（圖2 a）通常需要經過干化處理來提高萌發率。本研究中干化處理能使粗枝云杉體胚在形態上產生顯著的改變，相比于未干化的體胚，干化7 d 后體胚的胚根處逐漸變紅，隨著干化時間增加紅色隨之加深（圖2 b），而在干化14 d 后體胚形成綠色子葉（圖2 c）。干化處理后的體胚在萌發培養基中具有較高的萌發率，如圖2 d 所示，萌發20 d 后胚軸伸長明顯。體胚苗轉接至培養瓶后胚根繼續萌發（圖2 e），子葉逐漸展開，隨后逐漸形成針葉（圖2 f）。

圖2 粗枝云杉體胚干化和萌發過程Fig.2 Somatic embryo desiccation and germination of P.asperata

2.2 干化時間對云杉體胚萌發的影響

為探究干化對體胚的形態影響，本研究觀察了不同干化時間粗枝云杉體胚的形態變化，研究對比了干化0、1、7、9 和14 d 的體胚以及其萌發6 d的形態特征。結果發現，未干化和干化1 d 體胚胚根處均沒有明顯的紅色色素沉積，其中未干化的體胚（圖3a）萌發后容易形成玻璃化體胚，胚軸伸長緩慢，子葉分化停滯（圖3f）。干化1 d 的體胚誘導萌發后可以形成較為明顯的綠色子葉，且胚軸伸長顯著，然而胚軸和胚根呈半透明狀（圖3b，g）。干化7 d 和9 d 的粗枝云杉體胚胚根處呈明顯紅色，萌發后的胚軸伸長顯著，但胚軸和胚根處仍呈半透明狀（圖3c，d，h，i）。而干化14 d 的體胚胚根紅色最為明顯，子葉呈淺綠色，萌發后發育正常，幾乎不再出現玻璃化現象，子葉進一步分化，逐漸形成針葉的雛形（圖3j），胚軸和胚根緊實，不再具有半透明特征。

圖3 干化處理不同時期粗枝云杉體胚的萌發狀態Fig.3 The germination state of somatic embryos of P.asperata at different periods under desiccation

為了高效地利用干化技術促進云杉體胚萌發，本研究探究了不同干化時間對體胚萌發率的影響，統計了未干化、干化1、7、9、12、14、20 和28 d 的粗枝云杉體胚萌發30 d 的生根率。結果發現隨著干化時間的增加體胚的萌發率逐漸提高，干化7 d 體胚的萌發率便能顯著高于未干化體胚，且為未干化體胚的3 倍左右。而干化14 d 體胚萌發率達到最高，約72%，顯著高于其他干化時間的體胚。之后干化時間的增加不再顯著提高萌發率，干化28 d 時體胚萌發率降低至55%左右（圖4）。

圖4 不同干化處理時期粗枝云杉體胚生根情況Fig.4 Rooting of somatic embryos of P.asperata at different desiccation stages

2.3 干化處理云杉體胚的顯微結構變化

為深入探究干化對云杉體胚形態造成的影響，研究利用了光學顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡分別觀察了并對比了未干化和干化14 d 粗枝云杉體胚表面和細胞內的顯微和超微結構。掃描電鏡觀察結果發現未干化體胚（圖5a）和干化14 d體胚（圖5d）表面存在顯著差異，干化14 d 后體胚的表面呈皺縮狀。高倍視野下觀察可見，體胚子葉表面細胞因干化失水出現離散現象，組織表面呈皺縮狀（圖5b、e）。相對未干化體胚下胚軸（圖5c），干化體胚下胚軸表面（圖5f）的細胞同樣表現出皺縮狀，呈不規則排列。

圖5 干化體胚外表面超微結構Fig.5 Ultrastructure of outer surface of somatic embryo after desiccation

研究通過光學顯微觀察了未干化和干化14 d粗枝云杉體胚的顯微結構，結果發現未干化體胚（圖6a）和干化14 d 體胚（圖6e）之間解剖結構存在顯著差異。干化處理后體胚（圖6f）的頂端分生組織較未干化體胚（圖6b）明顯凸起，細胞數量增多。此外，干化14 d 體胚上胚軸（圖6g）和下胚軸（圖6h）的細胞均變得皺縮且分布不規則，不同于干化前（圖6c，d）整齊飽滿的細胞特征。特別是下胚軸部分，干化后組織結構呈現出明顯的空洞（圖6h），但并未破壞根頂端分生組織。這種細胞皺縮的現象與掃描電鏡觀察的結果相一致，我們推測這種結構變化可能與干化體胚萌發率提高有密切關系。

圖6 干化體胚顯微結構Fig.6 Microstructure of somatic embryo after desiccation

透射電鏡的結果發現未干化體胚上胚軸和下胚軸的細飽形態飽滿，其中上胚軸細胞呈規則的多邊形，能觀察到明顯的初生壁和細胞角隅（圖7 a，c）；下胚軸細胞呈橢圓形，細胞壁分化程度相對較低（圖7 b，d）。不同的是，干化14 d 體胚胚軸處細胞的形態受到破壞，呈現出明顯的皺縮狀（圖7 e，g），高倍視野下細胞壁不再具有剛性，且表現出松弛的扭曲狀（圖7 f，h），特別是下胚軸細胞基本已經無法觀察到細胞壁分層結構（圖7 h）。此外，未干化的成熟體胚細胞中富含淀粉粒（SG）（圖7 i），而經過干化處理后體胚細胞中淀粉?；鞠?，但脂質體（LPS）的數量顯著增多（圖7 j）。

圖7 干化體胚細胞超微結構Fig.7 Ultrastructure of cells of somatic embryo after desiccation

2.4 干化處理云杉體胚差異表達轉錄本分析

為了探究導致干化后粗枝云杉體胚表型變化的內在分子調控因素。本研究分析了干化處理前后粗枝云杉體胚子葉和胚根的轉錄本表達數據，其中未干化體胚子葉檢測到20 512 個轉錄本（CD0）、未干化體胚胚根檢測到20 802 個轉錄本（RD0）、干化處理14 d 體胚子葉含有21 867 個轉錄本（CD14）以及干化處理14 d 體胚胚根檢測到22 032 個轉錄本（RD14）（Lu 等，2019）。其中CD14 含有299 個特異的轉錄本，RD14 含有435 個特異轉錄本（圖8a）。差異表達分析發現，CD14 vs CD0 比較組中分別檢測到4 977 和1 683 個轉錄本顯著上調和下調（圖8b）。而在RD14 vs RD0 比較組中，共發現4 284 個轉錄本顯著上調，1 571 個轉錄本顯著下調（圖8c）。這些轉錄本是挖掘響應干化候選基因的主要目標。

圖8 干化粗枝云杉體胚子葉和胚根的差異表達轉錄本分析Fig.8 Analysis of differentially expressed transcripts in cotyledon and radicle of somatic embryo after desiccation

本研究已通過解剖結構觀察發現干化導致粗枝云杉體胚細胞壁松弛，細胞不再具規則多邊形形態，排列疏松。細胞壁松弛和重塑與膨脹素基因（Expansins，EXPA）、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶基因（ Xyloglucar endotransglucosylase/hydrolase，XTH）及葡萄糖基水解酶基因（βglucosidase，BGLU）等相關。轉錄組分析（圖9）顯示29 個影響細胞壁微纖絲構型的XTHs轉錄本中大部分顯著上調2 倍以上，僅MA_144503g0010成員在干化子葉和胚根中均顯著下調。類似的，發現16 個細胞擴展的EXPAs轉錄本在干化后體胚中差異表達，MA_467939g0010 和MA_10425823g 0010 表達量（RPKM）均超過50，具有較高的表達水平，且在干化胚根中表達分別為未干化胚根的5.54 和2.75 倍，暗示了它們可能是響應干化影響細胞延展性的關鍵轉錄本。此外，研究還發現了9 個干化后顯著上調和3 個干化后顯著下調的PMEs轉錄本。該類基因參與細胞壁果膠的甲酯化過程，影響細胞壁的剛性，它們的差異表達可能是干化體胚細胞壁機械強度和流動性改變的潛在原因之一。由此可見，這些細胞性質決定基因的差異表達可能共同導致了干化體胚細胞壁重塑，促使其表現出松弛狀態。

圖9 干化體胚細胞壁重塑轉錄本差異表達分析Fig.9 Differential expression analysis of cell wall remodeling transcripts of somatic embryo after desiccation

3 討論

體細胞胚與合子胚的發育過程高度相似，合子胚在成熟過程中往往會經歷脫水耐受和后熟階段，以促進新陳代謝的重組和貯藏化合物積累（蛋白質、脂肪和碳水化合物）為萌發作準備。如果未達到適宜的條件，即使形態上完整的胚也不能夠保證正常的萌發[13]。研究人員參照合子胚獲得脫水耐受性能促進萌發的模式，采用干化處理來促進體胚的萌發[3]。

干化對體胚的影響類似于大多數合子胚萌發需經歷的后熟過程，其誘導的分子和生物學變化不是單純的延長成熟階段[14]。干化就像起到了一種使胚從“發育模式”轉向“萌發模式”的“開關”作用。有研究發現，形態成熟的體胚在干化處理后進一步改變了狀態，比較明顯的例子是粗枝云杉體胚在干化后胚軸和子葉呈深綠色，胚根轉變為深紅色[6]，這也成為了鑒別粗枝云杉干化成功與否的標志。在此基礎之上，本研究觀察并比較了干化后粗枝云杉體胚微觀解剖特征的變化。掃描電鏡超微結構觀察發現粗枝云杉體胚干化14 d 后體胚外表皮呈皺縮狀，該結果與白云杉干化體胚表皮皺縮結果一致[8]。光學顯微和透射電鏡的細胞超微結構進一步發現干化后粗枝云杉體胚細胞排列疏松表現出明顯的形變特征，細胞壁不再具有規則剛性結構，表現為松弛狀態。隨著研究的深入，研究人員發現植物細胞的生長和分化與細胞壁延展性的變化有關[15]，也逐漸意識到細胞分化過程中，細胞壁的組成、機械性質等發生改變不再只是細胞分化的“結果”，也可能會反過來調控細胞分化[16]，例如，細胞壁果膠甲酯化程度降低利于葉原基的分化[17]；Tabernaemontana catharinensisA.DC.的乳汁管分化和生長始于莖尖細胞壁的分解和松散[18]。纖維素細胞壁的正確構建對于植物細胞的塑造和分化至關重要[19]。因此，我們推測干化導致的體胚細胞壁松弛可能解除了細胞壁對細胞分化和伸長的束縛，利于器官的形成，提高體胚萌發率。

細胞壁的松弛主要由多種蛋白質介導，包括EXPA、XTH 和BGLU[20]。其中EXPA 是一類最早被發現作為細胞壁pH 依賴性延伸的介質蛋白，可分為EXPA、EXPB、EXLA 和EXLB 四個亞家族[21]。在酸性條件下被激活，并通過改變纖維素微纖維和木葡聚糖之間的交聯而誘導不可逆的壁延伸[15,20]。這種細胞壁的延展性變化直接影響植物器官的發育，有研究表明擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）種子萌發前EXPA2 能調節胚乳細胞擴張輔助胚的生長[22]。本研究發現多個EXPAs在干化體胚中顯著上調表達，可能是導致細胞壁松弛的主要因素，驅動了胚胎細胞的擴張，這可能也是導致干化粗枝云杉體胚萌發過程中胚軸顯著伸長的原因。類似的，XTH 負責圍繞著纖維素微纖絲的木葡聚糖分子的裂解和連接，導致細胞壁松弛和重塑，該基因的表達直接與細胞擴展性和胚軸伸長相關[23-24]，因為木葡聚糖是通過氫鍵與纖維素微纖絲結合，該結構變化有助于細胞伸長過程中細胞壁的松動或硬化[25]。本研究中多個XTHs在干化粗枝云杉體胚中顯著差異表達，且大部分上調表達，可能進一步改變了干化粗枝云杉體胚細胞壁的物理性質，促進了組織分化和生長。細胞壁中果膠能夠在水合作用和硬度方面發生巨大變化，從而改變細胞和組織的表型，例如，增加細胞壁果膠的硬度可能會導致細胞生長下降。另一方面，果膠的甲酯化程度決定了細胞壁的剛性、流動性等物理性質，通常果膠甲酯化程度越低細胞壁機械強度越高[26]，這一過程由果膠甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）介導完成，PME 主要行使去甲酯化的作用[27]，調節細胞壁中果膠的甲酯化程度來影響細胞的生長和發育。已有報道表明果膠的去甲酯化是歐洲栓皮櫟（Quercus suberL.）體胚發生所必需的[28]。粗枝云杉體胚干化后9 個顯著上調，3 個顯著下調的PMEs可能也參與了體胚細胞壁強度調控，PMEs抑制表達是細胞壁流動性增強的因素，而多個PMEs上調表達理論可能限制細胞的生長，這不符合干化降低細胞壁對細胞生長限制的假設，推測下調表達的PMEs可能才是真正在干化過程中行使功能的，此外，該過程可能還存在果膠甲酯酶抑制因子（Pectin methylesterase inhibitor，PMEI）等基因參與其中，類似與花粉管伸長由PME 和PMEI 兩類分子合作完成[29]。值得注意的是，在細胞擴展整個過程中，細胞壁的松弛、重塑和合成必須協調進行，使細胞壁在適應生長的同時，維持完整性[30]。這其中涉及多種基因的共同調控作用。介于此，我們認為EXPAs、XTHs以及PMEs等影響細胞壁性質的基因差異表達，降低了粗枝云杉體胚下胚軸細胞壁剛性，解除了胚根細胞伸長的結構限制，最終協同調控了體胚細胞生長和分化，最終為萌發創造了條件。

4 結論

干化14 d 能有效提高粗枝云杉體胚萌發率。顯微和超微結構觀察發現干化后體胚子葉和胚根細胞離散分布，細胞壁剛性結構消失，呈松弛形態。多個影響細胞壁性質和參與細胞壁重塑的基因，如EXPAs、XTHs和PMEs在干化體胚中顯著高表達是這一現象產生的潛在原因。本研究認為干化導致的體胚細胞壁松弛可能解除了細胞壁對細胞分化和生長的限制，從而促進了云杉體胚萌發。