氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定涉案奶粉中辛硫磷的含量

黃玉敏，潘彤，劉清波，孫茂，孫鵬飛，吳元明

（空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，陜西西安 710032）

辛硫磷（phoxim）又名倍腈松，是一種廣譜有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，最早于1965 年由德國(guó)拜耳公司研發(fā)而得，因其廣譜性、高效性和低殘留等特點(diǎn)，深受國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)歡迎，并廣泛應(yīng)用于果蔬、茶葉和小麥等農(nóng)作物的害蟲(chóng)防治[1]。 辛硫磷作為世界上生產(chǎn)和銷售量最大的殺蟲(chóng)劑之一，各個(gè)國(guó)家對(duì)其使用、經(jīng)營(yíng)都有嚴(yán)格的管理規(guī)定，但因其價(jià)格低廉且在獲取上相對(duì)容易。 近年來(lái)，使用辛硫磷自殺、投毒、誤服等各類復(fù)雜中毒案件頻發(fā)，給法醫(yī)毒物檢驗(yàn)工作帶來(lái)一定的難度。 辛硫磷進(jìn)入人體后，主要通過(guò)抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿在體內(nèi)大量積累，從而引起神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)障礙，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)乏力、頭暈、多汗、惡心和食欲缺乏等癥狀，嚴(yán)重者甚至死亡[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)辛硫磷的關(guān)注重點(diǎn)主要集中在環(huán)境及食品安全領(lǐng)域，如采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、薄層色譜掃描、電化學(xué)傳感器及凝膠滲透色譜等[3]分析方法來(lái)檢測(cè)不同農(nóng)作物、水產(chǎn)品、水果、土壤等樣本中辛硫磷的殘留[4]。 而在法醫(yī)毒物領(lǐng)域的研究則相對(duì)較少，楊玉梅等[5]、李石友等[6]提供了小麥粉、牛奶中辛硫磷檢測(cè)的方法和思路，但因投毒案件復(fù)雜、檢材多樣（如飲用水、食品、食物器皿等），不同形態(tài)的食品或添加劑對(duì)法醫(yī)毒物檢驗(yàn)工作都是一次重大挑戰(zhàn)。 為此，基于真實(shí)奶粉投毒案件，本文建立一種奶粉中辛硫磷的檢測(cè)方法，以期對(duì)同類案件提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890A-5975A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Aglient公司），配有電子轟擊離子源；TDL-40B型離心機(jī)（上海安亭電子儀器有限公司）；QL-861型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；ND200-1型氮吹儀（杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司）；Florisil固相萃取柱（粒徑150～250 μm，德國(guó)Simon Aldrich公司）。

辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所）；乙腈、甲醇均為色譜純；丙酮、乙酸乙酯、正己烷均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液系列：先將辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用空白奶粉溶液將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、0.50、2.50、5.00 mg/L 的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液系列。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

色譜條件 DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm，0.25μm）；進(jìn)樣口溫度200℃。 色譜柱升溫程序：初始溫度100℃，保持1.5min，以20 ℃/min 的速率升溫至180 ℃，保持15 min。 載氣為氦氣（純度≥99.999%）；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度200 ℃；采用全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍m/z50～500。

1.2.2 提取溶劑比較

稱取涉案奶粉5.028 5 g 溶于25 mL 超純水中，分別加入10 mL 不同有機(jī)溶劑（乙腈、丙酮、甲醇、乙酸乙酯）提取，旋渦振蕩混勻，提取2 次，提取液經(jīng)濾紙過(guò)濾后合并兩次濾液。 參照楊玉梅等[5]的報(bào)道，用Florisil 固相萃取柱對(duì)濾液進(jìn)行萃取，分別經(jīng)與其對(duì)應(yīng)的有機(jī)溶劑-正己烷（體積比為1 ∶4）溶液淋洗，以6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心甩干萃取柱，分別用相應(yīng)的提取溶劑進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，于40 ℃下氮吹至近干，加入100 μL 提取溶劑復(fù)溶，以供氣相色譜-質(zhì)譜儀分析。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 工作曲線與檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以辛硫磷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，辛硫磷的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。以3 倍信噪比計(jì)算檢出限。

1.3.2 回收率實(shí)驗(yàn)

對(duì)市售不含辛硫磷成分的奶粉（空白奶粉）樣品進(jìn)行3 個(gè)質(zhì)量濃度（0.1、0.5、2.5 mg/L）的添加辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品回收實(shí)驗(yàn)，分別以乙腈、丙酮、甲醇、乙酸乙酯作為提取試劑對(duì)樣品進(jìn)行前處理，計(jì)算各處理?xiàng)l件下辛硫磷的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。辛硫磷的回收率計(jì)算方法如式（1）所示：

其中：W表示辛硫磷的回收率；A表示奶粉添加樣的測(cè)定值；B表示辛硫磷加標(biāo)量的值。

1.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)建立的辛硫磷檢測(cè)方法進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，主要對(duì)日間RSD 和日內(nèi)RSD 進(jìn)行比較，以作方法精密度評(píng)價(jià)。

1.4 案例應(yīng)用

涉案樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置了空白對(duì)照、檢材樣品、添加辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照樣品。 其中，空白對(duì)照使用空白奶粉，陽(yáng)性對(duì)照樣品為空白奶粉添加辛硫磷對(duì)照品。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑

辛硫磷不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、丙酮、甲醇、乙酸乙酯這4種有機(jī)溶劑對(duì)辛硫磷提取效果的影響。 4種有機(jī)溶劑對(duì)空白奶粉中添加辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品回收率的比較結(jié)果見(jiàn)表1。 由表1可知，丙酮、乙酸乙酯對(duì)于添加低、中、高質(zhì)量濃度的辛硫磷奶粉提取效果較好，回收率為98.2%～104%，RSD為2.1%～8.3%，乙腈的提取效果次之，甲醇的提取效果相對(duì)較差。 而丙酮毒性較大，容易對(duì)人體造成傷害，不宜大量使用，故實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯作為提取試劑。

2.1.2 色譜條件

辛硫磷在高溫條件下較易分解，使用氣相色譜儀檢測(cè)時(shí)，進(jìn)樣口溫度的高低對(duì)辛硫磷熱分解產(chǎn)物出峰直接產(chǎn)生影響，鑒于此特性，實(shí)驗(yàn)設(shè)置進(jìn)樣口溫度分別為180、200、250 ℃，并添加質(zhì)量濃度為5.00 mg/L 的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，測(cè)得各溫度下辛硫磷的色譜峰面積如圖1 所示。 從圖1 可以看出：辛硫磷的色譜峰面積隨著進(jìn)樣口溫度的升高呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢(shì)，當(dāng)進(jìn)樣口溫度為200 ℃時(shí)，色譜峰面積最大，為保證辛硫磷的穩(wěn)定性和獲得更好的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)確定進(jìn)樣口溫度為200 ℃。

圖1 進(jìn)樣口溫度對(duì)辛硫磷色譜峰面積的影響

2.2 工作曲線與檢出限

質(zhì)量濃度為5.00 mg/L的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖2 所示，其相對(duì)保留時(shí)間為8.377 min，在進(jìn)樣口溫度為200 ℃的色譜條件下，辛硫磷在0.10～5.00 mg/L 內(nèi)與其色譜峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=（19.28x-31.12）×104。 添加低質(zhì)量濃度的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以樣品基線的3 倍信噪比計(jì)算檢出限為0.05 mg/L。

圖2 辛硫磷的色譜圖（質(zhì)量濃度5.00 mg/L）

2.3 涉案檢材中辛硫磷的檢測(cè)

采用最優(yōu)樣本前處理方法與儀器工作條件，對(duì)涉案奶粉中的辛硫磷進(jìn)行檢測(cè)。 空白奶粉中未檢出辛硫磷或其他物質(zhì)，空白對(duì)照無(wú)干擾。 如圖3（a）和圖3（b）所示，檢材樣品的主要色譜峰保留時(shí)間為8.377min，該色譜峰所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖碎片離子為：m/z109（基峰）、m/z135、m/z298，對(duì)比空白奶粉添加辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，發(fā)現(xiàn)色譜峰保留時(shí)間與辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同， 且質(zhì)譜特征峰及其豐度比與空白奶粉添加辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相似。

圖3 檢材樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖

2020年9月，某公安局接到報(bào)警，報(bào)警人稱其家中飲水機(jī)、奶粉等多處異常，懷疑被投毒，警方向某鑒定所提供奶粉盒、奶粉、調(diào)料盒、飲水機(jī)桶檢材，經(jīng)過(guò)初步篩查，懷疑奶粉中含有辛硫磷，采用本文方法對(duì)涉案奶粉進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示檢出辛硫磷。 由工作曲線計(jì)算出涉案奶粉中辛硫磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.17mg/kg。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取添加0.1、0.5、2.5 mg/L 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的奶粉溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算樣品的日內(nèi)RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。同樣，取添加0.1、0.5、2.5 mg/L 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的奶粉溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5d，計(jì)算樣品的日間RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。 結(jié)果表明：日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間的RSD為0.26%～0.48%，含量RSD 為4.0 %～5.5%；日間精密度實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間的RSD 為0.28%～0.67%，含量RSD 為5.8%～7.8%，這說(shuō)明方法穩(wěn)定性良好。

表2 日內(nèi)精密度和日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3 討論

目前，已報(bào)道的關(guān)于在食品中檢測(cè)辛硫磷的方法以高效液相色譜法居多，例如王勇等[7]、李欣等[8]、劉飛翔等[9]分別使用該方法檢測(cè)了濃縮胡蘿卜汁、番茄醬、小麥和大米中的辛硫磷殘留。 雖然高效液相色譜法檢測(cè)靈敏度高、用時(shí)少，但存在設(shè)備價(jià)格昂貴、體積較大、可行性不高等缺陷，不利于在司法鑒定領(lǐng)域推廣。 在司法鑒定領(lǐng)域，王龍志等[2]使用GC-MS 檢測(cè)涉案水樣中辛硫磷殘留。 GC-MS 與LC-MS 相較設(shè)備價(jià)格較低、較易推廣，但檢出限較高與常規(guī)應(yīng)用中進(jìn)樣口溫度在250 ℃以上的限制，不利于辛硫磷的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯萃取，雜質(zhì)較少，效果較佳；設(shè)置適當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣口溫度，避免了檢出限高、辛硫磷高溫易分解的問(wèn)題；采用GC-MS 對(duì)涉案奶粉中辛硫磷進(jìn)行檢測(cè)，方法操作簡(jiǎn)單、可行性強(qiáng)，可為其他復(fù)雜案件檢材中辛硫磷成分的檢測(cè)提供參考。 辛硫磷作為廣譜殺蟲(chóng)劑在現(xiàn)實(shí)生活中較為常見(jiàn)，中毒案件也較為頻發(fā)，建立一種快速、高效、便捷的檢測(cè)方法（如試紙、檢測(cè)板等），避免意外中毒是進(jìn)一步探討和研究的重要方向。