腫瘤標志物及EMT通路表達水平對黑色素瘤預后的影響

王 倩

(空軍軍醫大學第二附屬醫院皮膚科,陜西 西安 710038)

黑色素瘤是一種源于黑色素細胞的高度惡性皮膚腫瘤[1],我國每年新發患者超過8 000例。黑色素瘤的發生與人體的遺傳基因、免疫系統、環境因素等多種因素有關[2]。黑色素瘤的治療主要包括手術切除[3]、放射治療、化療、免疫治療等[4]。手術切除是最常見的治療方式,早期發現并及時切除,患者的治愈率較高。但黑色素瘤是病死率較高的一種惡性腫瘤,具有較高的轉移潛能[5]。復發和轉移是患者死亡的主要原因,近年來對黑色素瘤轉移和侵襲機制的深入研究,很大程度上提高了患者的生存率。

腫瘤細胞發生上皮-間充質轉化(EMT)被認為是癌癥轉移的起始和關鍵步驟之一[6]。EMT是上皮細胞在特定病理生理條件下轉換為在形態學上具有間充質表型細胞的過程,其發生會導致細胞黏附和機械性能的顯著改變,包括細胞間連接破壞、細胞骨架重組和細胞運動性增加[7]。因此,細胞力學特性在腫瘤進展中起著關鍵作用。近年來,基因檢測技術的應用能幫助醫生識別黑色素瘤的高危患者,也有助于接受靶向治療患者的“對癥用藥”和預后評估[8]。然而,基因檢測花費較高并且受到地區醫療條件限制,多數患者無法進行檢測。本研究采用生物信息學分析,探究常規黑色素瘤腫瘤標志物表達與EMT通路的關系,為識別和隨訪高轉移風險的黑色素瘤患者提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料來源 從TCGA數據庫下載黑色素瘤患者腫瘤組織的轉錄數據、蛋白表達數據和對應的臨床數據。為黑色素瘤確診患者,共472例,其中男293例,年齡18～90歲,平均(57.91±15.38)歲;女179例,年齡15～90歲,平均(58.56±16.25)歲。樣本納入標準:經病理證實為黑色素瘤,具有完整的臨床預后數據。經過分析后共461例黑色素瘤患者納入研究。

1.2方法

1.2.1EMT相關通路對于預后的影響 通過GSEA網站(https://www.gsea-msigdb.org/),以“Melanoma EMT”為檢索詞進行搜索,最終下載EMT相關基因集ALONSO_METASTASIS_EMT_UP(EMT相關通路),其中包含相關基因35個。使用R語言中的GSVA包對每個樣本的表達進行非參數的無監督分析,最終得到EMT相關通路的表達評分。根據評分的中位數將樣本分成高、低兩組,并使用Survival包進行生存分析。

1.2.2腫瘤標志物的mRNA與EMT相關通路的相關性 提取黑色素瘤患者腫瘤標志物mRNA表達水平,包括S100A1、PMEL、MLANA、TYR、MITF及MKI67。并將其與每個樣本對應的EMT相關通路的表達評分進行Spearman相關性分析。隨后根據年齡、性別和腫瘤分期進行上述相關性的亞組分析。

1.2.3不同表達水平的腫瘤標志物與EMT相關通路對預后的影響 分別根據S100A1、PMEL、MLANA、TYR、MITF和MKI67的中位數將樣本分成高低兩組,在各組中使用Survival軟件包分析EMT相關通路對預后的影響。然后,再根據EMT相關通路評分將樣本分為兩組,分別探討上述腫瘤標志物表達水平對預后的影響。

1.2.4腫瘤標志物的蛋白表達水平與EMT相關通路的相關性 從TCGA數據庫下載黑色素瘤患者腫瘤標志物的蛋白表達水平,獲得具有蛋白表達數據的樣本352例。將蛋白表達數據與樣本的EMT相關通路評分進行合并,獲得轉錄組數據和蛋白表達數據能對應的樣本343例。最后將腫瘤標志物蛋白表達水平與每個樣本對應的EMT通路的表達評分進行Spearman相關性分析。

1.3統計學處理 本研究中的統計分析使用R軟件(4.2.3)完成,Spearman相關性分析計算腫瘤標志物的表達水平和EMT通路的相關性;Kaplan-Meier 曲線比較腫瘤標志物不同表達水平及EMT通路與腫瘤總生存期的差異;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1EMT相關通路對預后的影響 根據EMT通路表達評分的中位數將樣本分成高低兩組(圖1A);生存分析結果顯示,EMT相關通路的高表達預示黑色素瘤患者的不良預后(P<0.05),見圖1B。

注：A.黑色素瘤組織EMT相關通路中基因的表達;B.EMT相關通路高表達組預示不良預后。

2.2腫瘤標志物的mRNA與EMT相關通路的相關性 Spearman相關性分析結果表明,S100A1、PMEL、MLANA、TYR及MITF與EMT通路呈負相關(P<0.05),而MKI67與EMT相關通路呈正相關(P<0.05),見圖2。

圖2 常見腫瘤標志物的mRNA表達水平與EMT通路的相關性

2.3腫瘤標志物mRNA與EMT相關通路的亞組分析 分別按年齡(≤65歲和>65歲)、性別(男和女)、分期(0～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ)將樣本分成兩組,在各組中將2.2中的腫瘤標志物與對應的EMT通路的表達評分進行Spearman相關性分析,探究2.2中得到的結果在不同亞組中是否一致。結果表明,65歲及以下和65歲以上患者有一致的結果,即PMEL、MLANA、TYR、MITF與EMT通路呈負相關(P<0.05),而MKI67與EMT通路呈正相關(P<0.05);男性患者的結果與總樣本所得結果一致,女性患者PMEL、MLANA與EMT通路呈負相關(P<0.05),MKI67與EMT通路呈正相關(P<0.05);0～Ⅱ期患者結果與總樣本所得結果一致,Ⅲ～Ⅳ期患者PMEL、MLANA、TYR、MITF與EMT通路呈負相關(P<0.05),見表1。亞組分析結果與總樣本中所得結果基本一致。

表1 腫瘤標志物mRNA水平與EMT相關通路相關性的亞組分析(r)

2.4不同表達水平的腫瘤標志物與EMT相關通路對預后的影響 結果顯示PMEL高表達和EMT通路低表達時預后良好,見圖3A、B;EMT相關通路低表達時MLANA高表達、MKI67低表達,預示預后良好(P<0.05),見圖3C、D。

注：A.PMEL高表達時,EMT相關通路低表達預示著預后良好;B.EMT相關通路低表達時,PMEL高表達的患者可獲得更好預后;C.EMT相關通路低表達時,MLANA高表達預示更好預后;D.EMT相關通路低表達時,MKI67低表達的患者可獲得更好預后。

2.5腫瘤標志物蛋白表達水平與EMT通路的相關性 考慮到上述結果僅是mRNA與EMT通路的相關性,而臨床上腫瘤標志物的檢測常檢測的是蛋白質。因此,進一步下載了黑色素瘤患者蛋白表達數據,并進行相關性分析。TCGA數據庫中缺乏TYR和MKI67的蛋白表達數據,故進行了其他4種腫瘤標志物蛋白表達的分析。結果顯示,PMEL、MLANA、MITF與EMT通路的表達呈負相關(P<0.05),見圖4,與圖2中對應的mRNA與EMT通路相關性結果一致。

注：A.S100A1蛋白表達水平與EMT通路呈正相關(P<0.05);B.PMEL蛋白表達水平與EMT通路呈負相關(P<0.05);C.MLANA蛋白表達水平與EMT通路呈負相關(P<0.05);D.MITE蛋白表達水平與EMT通路呈負相關(P<0.05)。

2.6影響惡性黑色素瘤預后的因素分析 單因素分析結果顯示,PMEL、MKI67、EMT相關通路、年齡和病理分期是惡性黑色素瘤預后的影響因素。進一步將上述因素納入多因素分析,結果顯示PMEL、年齡和病理分期是惡性黑色素瘤預后的影響因素(P<0.05),見表2。

表2 腫瘤標志物mRNA水平和EMT相關通路的因素分析

3 討 論

惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高的腫瘤,起源于外胚層的神經嵴,常見于皮膚、眼葡萄膜、消化道、呼吸道和泌尿生殖道等部位[9]。黑色素瘤較強的轉移、侵襲能力在其復發和轉移過程中發揮著重要作用。而EMT是上皮細胞在特定病理生理條件下轉換為在形態學上具有間充質表型細胞的過程[10],也是腫瘤轉移、侵襲的重要機制。

基因檢測的應用極大幫助了醫護人員評估黑色素瘤患者的復發和轉移風險,也有助于隨訪計劃的制訂。但因其應用也存在局限性[11],一是并非所有黑色素瘤患者均需要進行基因檢測,二是基因檢測的費用較高也限制了其推廣,也給醫護人員的隨訪帶來一定困難。由于黑色素瘤患者大多會接受病理組織活檢和(或)免疫組織化學(免疫組化)檢測[12],因此作者想探究能否通過常見黑色素瘤腫瘤標志物的免疫組化結果來評估患者的復發和轉移風險。本研究旨在了解EMT是否對黑色素瘤患者的預后存在影響,以及黑色素瘤腫瘤標志物是否與EMT存在相關性。

根據《黑色素瘤病理診斷臨床實踐指南(2021版)》[13],常用于臨床診斷和預后判斷的腫瘤標志物包括S100A1、PMEL、MLANA、TYR及MITF等。本研究分析了上述部分腫瘤標志物和EMT通路的相關性。結果顯示,EMT通路的高表達預示著患者的不良預后,黑色素瘤腫瘤標志物PMEL、MLANA、TYR和MITF的mRNA表達水平與EMT通路呈負相關(P<0.05);MKI67的mRNA表達水平與EMT通路呈正相關(P<0.05)。由于TCGA數據庫中蛋白表達數據有限,只發現PMEL、MLANA和MITF的蛋白表達水平與EMT通路的表達呈負相關,這與對應的mRNA水平與EMT通路的相關性一致。S100A1被認為靈敏度最高,既往也有研究者將其和酪氨酸酶用于黑色素瘤預后的判斷[14]。S100A1與EMT的相關性研究較少,現有研究結果顯示在頭頸部鱗癌中與EMT呈正相關(P<0.05)[15];而本研究結果顯示,S100A1與EMT通路相關性較弱。盡管PMEL對黑色素瘤預后是否具有價值還尚存爭議,但本研究結果提示PMEL和EMT通路存在相關性,PMEL低表達可能預示黑色素瘤的高轉移潛能,而PMEL高表達和EMT通路低表達時預示預后良好。HEENEN等[16]也報道MLANA蛋白的減少預示著黑色素瘤患者的不良預后;本研究提示EMT通路可能是其中一條途徑,而EMT通路低表達時MLANA高表達也預示預后良好,這一結果與現有研究一致。MITF是黑素生成和黑素細胞發育的重要調節因子,有研究表明MITF的表達能促進局部增殖并抑制侵襲、炎癥和EMT轉化[17],MITF表達的缺失導致侵襲和EMT過程的增加,這與本研究一致,也提示MITF表達低的黑色素瘤患者EMT通路活躍,隨訪應注意遠處轉移的可能。MKI67是一種核蛋白,其在細胞周期的G1、S、G2和M期均有表達,但在靜止期(G0)的細胞中不表達[18],故MKI67的表達水平可以反映細胞增殖的活躍程度,其在黑色素瘤中高表達預示預后不良[19]。本研究結果顯示,MKI67與EMT通路呈正相關(P<0.05),當EMT低表達時MKI67高表達預示預后不良。年齡也是黑色素瘤轉移和預后的重要因素,高齡患者遠處轉移發生更早并與不良預后有關[20]。另外,黑色素瘤的病理分期也是影響預后的關鍵因素,分期越高往往代表更差的預后[21]。本研究結果也顯示,年齡和病理分期是影響黑色素瘤患者預后的獨立危險因素。

本研究對 TCGA 中黑色素瘤患者常見腫瘤標志物的轉錄組數據、臨床數據和蛋白表達數據進行了分析,最終發現PMEL、MLANA和MITF的mRNA和蛋白表達水平與EMT通路的表達呈負相關,而EMT通路表達低時PMEL高表達、MLANA高表達、MKI67低表達預示良好預后,并且年齡和病理分期也需考慮在內。多學科協作模式下隨訪管理中護士發揮著不可或缺的作用,本研究可能為主管護士識別和隨訪未接受基因檢測的高危患者提供一定依據。