VAV家族在膀胱尿路上皮癌中的表達及其與預后的關系

黃 翔,蔡宏佳,張 能

(遵義醫科大學附屬醫院泌尿外科,貴州 遵義 563000)

膀胱癌作為泌尿外科第二常見腫瘤,其高發病率和高病死率嚴重困擾著臨床醫生和患者[1],2020年全球膀胱癌新發病例約57萬例,死亡約21萬例[2]。其最為常見的病理類型為膀胱尿路上皮癌,主要特點為易復發、易進展,患者往往需要行多次手術治療及膀胱灌注化療,給患者及家庭帶來嚴重的經濟負擔。迄今為止,幾乎沒有特異性和有效的靶向治療。因此,尋找膀胱癌的潛在生物標志物并確定其潛在機制可能有助于找到新的治療方法。

VAV家族包括VAV1、VAV2和VAV3,這些蛋白質的主要功能是作為Rho-GTPase家族成員的鳥苷核苷酸交換因子(GEF)[3]。VAV家族是一個特殊亞類,因為它們是信號轉導過程中唯一受直接酪氨酸磷酸化正向調節的GEF。它們在細胞和組織上分布有重疊,但并不完全相同,這些蛋白質含有高度相似和復雜的結構,各自包含了多個功能結構域,并參與各種細胞信號傳導過程,包括調節細胞骨架組織、細胞轉化等[4]。它們在不同的細胞類型中都扮演了關鍵信號分子[5-7],還能作為促癌因素驅動下游多條通路來促進腫瘤的發生、發展。但是它們在膀胱尿路上皮癌中表達如何尚少見相關研究。為研究膀胱尿路上皮癌組織中VAV家族表達及意義,本實驗檢測了VAV家族在膀胱尿路上皮癌及正常膀胱尿路上皮組織中的表達,分析了VAV家族表達與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1數據來源 通過TCGA數據庫網站(https://portal.gdc.cancer.gov/) 下載膀胱尿路上皮癌的基因數據和臨床資料,一共獲得408例膀胱原發腫瘤患者和19例正常尿路上皮組織受試者的有效數據。

1.1.2標本來源 選取2020年1月至2021年12月在本院住院行膀胱腫瘤電切術且術后病理檢查結果證實為膀胱尿路上皮癌的患者標本60例(包括低級別和高級別膀胱尿路上皮癌各30例),以及30例行膀胱癌根治術后患者的正常膀胱黏膜(鏡下未發現癌細胞)。所有入選患者均有完整的臨床病理資料。

1.2方法

1.2.1數據處理 使用R語言進行數據提取與分析,主要使用的R語言有dplyr、tidyverse、limma、ggplot2、survival。

1.2.2主要實驗試劑 DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司,VAV1、VAV2一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司,VAV3一抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2.3免疫組織化學 膀胱尿路上皮癌組織石蠟切片脫蠟,PBS沖洗后加入山羊血清封閉液,滴加一抗,4 ℃過夜,PBS沖洗3次;滴加二抗,37 ℃ 30 min,PBS沖洗3次,滴加新鮮DAB顯色液,陽性為棕黃色,蘇木素復染,將切片依次置于分度無水乙醇和二甲苯中分別浸泡,中性樹膠封片。

免疫組織化學染色結果通過半定量計分的方法進行蛋白表達的評價,染色強度評分原則如下:不著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;陽性染色的百分比評分如下:<5%為0分、5%～25%為1分、>25%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分。最終免疫組織化學染色得分(0～7分)為組織標本的染色強度加上相對應的陽性染色百分比,總分0～1分為陰性,2～3分為弱陽性,4～7分為陽性。

1.3統計學處理 采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析,采用秩和檢驗對VAV1、VAV2、VAV3在不同組織中的表達差異進行統計學處理。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1TCGA數據中VAV家族在膀胱尿路上皮癌和正常膀胱尿路上皮組織中的表達情況 通過R語言軟件提取TCGA原始數據并分析后,結果顯示,VAV1在膀胱尿路上皮癌組織及正常膀胱尿路上皮組織中表達比較,差異無統計學意義(P>0.05),VAV2、VAV3在膀胱尿路上皮癌組織中表達高于正常膀胱尿路上皮組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 VAV家族在正常膀胱尿路上皮組織和膀胱尿路上皮癌組織中的表達情況

2.2免疫組織化學染色結果 通過免疫組織化學染色正常膀胱尿路上皮組織、低級別和高級別膀胱尿路上皮癌組織各30例,3種類型的組織又分別染色VAV1、VAV2、VAV3各10例,結果顯示,VAV1在正常膀胱尿路上皮組織和膀胱尿路上皮癌組織中表達比較,差異無統計學意義(P>0.05),VAV2、VAV3在膀胱尿路上皮癌中表達較在正常膀胱尿路上皮組織中增高,差異有統計學意義(P<0.05),VAV1、VAV2、VAV3在不同級別膀胱癌組織中表達比較,差異均無統計學意義(P>0.05),說明VAV1、VAV2、VAV3與膀胱的分化程度無明顯相關性(P>0.05),見表1、圖2。

表1 膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱尿路上皮組織中VAV家族的免疫組織化學染色結果

圖2 VAV家族在正常膀胱尿路上皮組織、低級別和高級別膀胱癌組織中的表達情況(免疫組織化學染色,20×)

2.3VAV家族與患者預后的關系 采用R語言進一步分析TCGA數據,提取出VAV1、VAV2、VAV3 mRNA表達量、生存時間及結局,繪制生存曲線圖,結果顯示,VAV1、VAV2的表達與患者生存時間無明顯相關性(P>0.05),VAV3表達越高,患者生存時間越短(P<0.000 1),見圖3。

圖3 VAV家族不同表達的膀胱癌患者生存曲線

3 討 論

VAV家族是GEF中的Dbl同源性亞家族中最著名的一類蛋白,GEF是催化Rho蛋白中鳥苷二磷酸(GDP)與三磷酸(GTP)交換的酶,使GTP酶在細胞信號傳導過程中從非活性快速轉變為活性GTP結合狀態。VAV蛋白在蛋白酪氨酸激酶控制的許多生物過程中發揮著關鍵作用。它們可以作為銜接蛋白,因此也體現了大多數Rho-GEF的調控復雜性。VAV蛋白對中樞神經、心血管和免疫系統的穩態至關重要[3,8]。

在本研究中,使用R語言提取TCGA的原始數據,分析結果發現VAV1在膀胱尿路上皮癌與正常膀胱尿路上皮組織中表達無明顯差異,而VAV2和VAV3在膀胱尿路上皮癌中的表達均高于正常膀胱尿路上皮組織。為驗證此結果,收集膀胱尿路上皮癌患者病理標本行免疫組織化學驗證,其結果與生物信息學數據相符。通過分析VAV2和VAV3與膀胱癌患者預后的關系,發現VAV3的高表達與患者不良預后有明確相關性,因此,VAV3作為膀胱癌重要的調節因子具有進一步探索的意義。

VAV3是Rho-GTP酶核苷酸交換因子VAV家族的第3個成員,參與各種細胞信號傳導過程,其通過經典的Dbl結構域激活Rho家族GTP酶,如RhoA、Rac1和Cdc42[9-10]。各種受體酪氨酸激酶(RTK)激活VAV蛋白,導致其底物的Dbl結構域開放[9,11]。VAV3還具有調節細胞運動、增殖和分化的功能。VAV3與癌癥的進展和復發相關,并介導對某些癌癥治療的抵抗[12]。

在VAV家族中,VAV3的缺乏會導致骨量密度增加[13]、交感神經過度活躍、心血管功能障礙和傷口愈合受損[13-15]。VAV3在腫瘤的發生和轉移中也扮演了重要角色。在前列腺癌中,VAV3通過提高AR-V7的活性導致去勢抵抗前列腺癌的發生[16]。在胃癌患者中也發現VAV3表達與腫瘤分化、腫瘤浸潤、淋巴結轉移、神經血管浸潤和臨床病理分期顯著相關,表明VAV3的表達與癌癥的浸潤、轉移和惡化呈正相關(P<0.05),同時生存分析也顯示,高表達VAV3的患者預后更差及生存時間更短[17]。

盡管本研究結果僅顯示VAV3與膀胱癌患者的不良預后有明顯關系,但是其他研究結果卻發現VAV2和VAV3在乳腺癌中共同作用可導致患者在總體生存率、腫瘤復發及轉移事件方面產生更加不良的預后。當VAV2或VAV3缺失時,癌癥細胞向肺的轉移能力受到損害,而當2種VAV蛋白同時缺失時,癌癥的轉移能力消失。VAV2;VAV3敲低細胞中2種VAV蛋白的異位共表達挽救了原發性腫瘤發生和肺轉移;相反,2種單一VAV蛋白中任何一種的再表達均未能恢復VAV2;VAV3敲低細胞的致瘤特性[18]。針對這一結果,考慮可能文獻的實驗結果是來自動物實驗,而作者的分析結果來源是TCGA下載的臨床數據,相同的基因在動物和人類中的表達情況或對預后的影響可能會出現差異,或者是因為TCGA的數據量不足而導致差異有統計學意義(P<0.05)。對于VAV2是否單獨或聯合VAV3產生作用,接下來還將通過科學研究來進一步驗證。

本研究結果顯示,VAV3的表達可能是預測膀胱尿路上皮癌患者預后的一個有價值的獨立危險因素,可能為進一步了解膀胱尿路上皮癌的發病機制帶來新思路,也能為治療提供新靶點。