Toll樣受體4基因單核苷酸多態性與白內障發病的相關性研究

蘇丹丹，王春紅，夏璐，吳凡

作者單位：皖南醫學院第二附屬醫院眼科，安徽 蕪湖241000

年齡相關性白內障（ARC）是最常見的白內障類型，也是全球致盲主要的原因［1-3］。國內外研究均表明，ARC 是環境、代謝、遺傳等因素共同作用的結果［4］。單核苷酸多態性（SNPs）是人類基因組中DNA 序列變異及遺傳多態性最常見的表現形式，作為一種良好的分子標記，SNPs已成為研究ARC遺傳易感性的重要手段［5］。有研究［6］表示，TLR4 可刺激機體釋放多種炎性因子，參與原發性開角型青光眼的發生與進展。為研究TLR4 基因的單核苷酸多態性（SNPs，rs4986790 及rs4986791 位點）是否與ARC之間存在關系，我院開展如下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料將皖南醫學院第二附屬醫院2021年1—12 月收治的100 例白內障病人納入觀察組。納入標準：病人年齡＞50 歲；最佳矯正視力＜0.5；經晶狀體病理及視力檢查確診為白內障。排除標準：青光眼、高度近視、葡萄膜炎及眼部外傷等其他原因引起的白內障者；合并糖尿病、腎臟疾病或全身性疾病及視網膜疾病者。

對照組為年齡、性別與觀察組相匹配的86例健康志愿者，其晶狀體透明，最佳矯正視力≥0.5，未合并其他眼科疾病。觀察組中男53例，女47例，年齡范圍為52～85歲，年齡（71.15±13.33）歲，白內障分型：皮質型38例，核型36例，后囊下型13例，混合型13例，對照組中男44例，女42例，年齡范圍為51～82歲，年齡（72.63±12.14）歲，兩組性別及年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 外周血細胞基因組DNA 制備 采集被研究者外周靜脈血4 mL，置于EDTA抗凝管，按照基因組DNA 提取試劑盒（美國Qiagen 公司）相關步驟提取DNA。吸取4 mL血液至15 mL離心管，加入8 mL紅細胞裂解液，裂解紅細胞，半徑10 cm離心機3 000 r∕min 離心10 min，留下管底白細胞團。漩渦震蕩30 s，充分分散白細胞團，加入4 mL 白細胞裂解液與40 μL蛋白酶K，再漩渦震蕩5 s，放入65 ℃恒溫水浴60 min后取出，待其自然冷卻至室溫后，加入1.5 mL飽和氯化鈉溶液，漩渦震蕩15 s，半徑10 cm、3 000 r∕min 離心10 min，加入4 mL 異丙醇，上下顛倒混勻10～15 次至出現沉淀，室溫、半徑10 cm、3 000 r∕min離心10 min，去掉上清液，留下管底白色沉淀。加入2 mL 75%乙醇，振蕩洗滌沉淀，半徑10 cm、3 000 r∕min離心10 min，棄上清液。離心管室溫干燥1～2 h，加入200 μL 滅菌雙蒸水充分溶解，低溫低速離心2 min，將液體集中保存在管底。NANODROP-2000 紫外分光光度儀檢測DNA 純度，OD260∕OD280 為1.7～2.0即符合擴增要求。

1.2.2 SNPs分型 （1）SNPs引物設計：在NCBI網站中找到rs7986790 及rs4986791 的DNA 序列，使用Primer Premier 5 軟件設計SNPs 位點的擴增引物及SNaPshot引物，rs7986790正向引物5"-AGACCTGT GGGTGAACCCTA-3"，反向引物5"-GCATTCCCACCTTTGTTGGA-3"，PCR 引 物 長 度 為 474 bp。rs4986791 正向引物5"-CTCTAGAGGGCCTGTGCAATTT-3"，反向引物5"-CTGGACAAGCCATTGAAGATGC-3"，PCR 引物長度為589 bp。（2）PCR 擴增反應體系：2×Es MasterMix（Dye） 5 μL，正、反向引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水3 μL。（3）PCR 反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，最適退火溫度30 s，72 ℃延伸30 s，從第二步到第四步時循環35次，72 ℃延伸5 min，擴增產物放于4 ℃保存。（4）SNaPshot 單堿基延伸測序：PCR 產物純化后進行SNaPshot單堿基延伸測序，反應體系：PCR純化產物2 μL，SNaPshot 產物0.2 μL×4，SNaPshot Multiplex 0.5 μL，雙蒸水1.7 μL。反應條件：96 ℃預變性1 min，96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，第二步到第四步循環25 次，4 ℃低溫備用。（5）二次純化后上機檢測基因型：取4 μL 二次純化產物，依次加入96 孔板，分別向每孔加入6 μL 雙蒸水稀釋，啟動ABI-3730XL 測序儀，開啟完畢后打開軟件，設定Cene Mapper 程序，將樣品放入測序儀內，采用Gene Mapper 5.0 軟件分析。（6）隨機挑選觀察組與對照組中5%樣本進行Sanger 測序，驗證采用SNaPshot 單堿基延伸序列法基因分型結果是否準確。

1.2.3 外周血單核細胞內腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素（IL）-6 水平檢測 （1）分離外周血單個核細胞（PBMC）：抽取被研究者外周靜脈血5 mL，置于肝素抗凝離心管內，加入等體積磷酸緩沖液（PBS）混勻，將稀釋后的血液加入淋巴細胞分離液表面，保持兩者之間的清晰分界，室溫下800×g離心25 min，把位于玻璃管中間部位的PBMC 細胞層小心吸出，加入適量PBS洗滌，室溫下800×g離心10 min，得到PBMC。（2）制備PBMC上清液。（3）收集PBMC上清液，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測PBMC 上清液中TNF-α及IL-6水平。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件處理。計量資料以±s表示，均行正態分布和方差齊性檢驗，不符合正態分布的變量進行自然對數轉化使其成正態或近似正態分布。兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，兩組TLR4 基因兩個多肽位點Hardy-Weinbery 平衡采用χ2檢驗，基因型個數通過計數方式獲得，兩組等位基因、基因型頻率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Toll 樣受體4 基因SNPs 位點等位基因Hardy-Wrinberg 平衡檢驗Hardy-Weinberg 平衡試驗結果提示，觀察組及對照組TLR4 基因rs7986790 位點及rs4986791 位點的基因型頻率分布實際值與理論值符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，說明吻合度良好（P＞0.05），所納入的樣本具有群體代表性。

2.2 兩組Toll 樣受體4 基因SNPs 位點等位基因及基因型分布比較兩組TLR4 基因rs7986790、rs4986791 位點基因型及其等位基因占比比較均差異無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 兩組Toll樣受體4基因SNPs位點等位基因及基因型分布比較∕［n∕N（%）］

2.3 rs7986790 不同基因型病人外周血單個核細胞上清液TNF-α 及IL-6 水平比較rs7986790 基因分型為GA（21 例）及GG（11 例）者PBMC 上清液中TNF-α 及IL-6 水 平［（22.36±4.15）μg∕L、（846.69±179.68）ng∕L］均高于基因型為AA（68例）者［（17.02±2.36）μg∕L、（613.45±163.59）ng∕L］，差異有統計學意義（t=8.19、6.44，均P＜0.001）。

3 討論

流行病學調查結果提示，遺傳因素在ARC中發揮著重要作用，既往研究［7-8］已發現眼發育相關基因、DNA修復相關基因以及轉錄相關基因等多種基因的SNPs均與ARC之間存在聯系。有研究［9-10］在白內障病人房水中檢測到TNF-α、IL-6、IL-1β等多種炎性因子。

TLRs是參與連接特異性免疫與非特異性免疫的一類重要的蛋白質分子，廣泛表達于中性粒細胞、單核-巨噬細胞等多種免疫細胞［11-12］，是免疫系統中重要的成員，其主要負責識別病原分子與傳遞信號。TLR4是目前研究最多的TLRs基因，其與惡性腫瘤及自身免疫性疾病的發生間均相關［13-14］。許致玉、張璐［15］研究報道，TLR4基因多態性還與年齡相關黃斑病變有關。TLR4激活后可促進細胞組織纖維化，促進小梁網與細胞外基質結構發生改變；一些全身性免疫系統性疾病如類風濕關節炎、強直性脊柱炎等，TLR4參與這些疾病的發病機制，而全身性免疫性疾病常伴有眼部的炎癥，如葡萄膜炎［16-17］。

本研究選取100 例ARC 病人作為觀察組，86 例年齡、性別相似，且與ARC病人間無血緣關系的健康者作為對照組，比較發現，兩組TLR4基因rs7986790位點基因型及其等位基因占比比較，差異有統計學意義，而兩組TLR4 基因rs4986791 位點的基因型及其等位基因占比間差異無統計學意義。其中ARC病人rs7986790 位點GA 及GG 型病人占比均高于健康對照組，提示G基因可能增加ARC病變風險。

對于rs7986790 位點不同基因型的ARC 病人外周血PBMC上清液中TNF-α以及IL-6水平發現，GG+GA基因型病人PBMC上清液中TNF-α以及IL-6水平均高于AA 型基因者。其中TNF-α 主要由單核細胞、巨噬細胞及胸腺依賴淋巴細胞產生，可參與免疫反應［18］，IL-6是一種多效應細胞因子，可調節包括免疫及炎癥反應在內的多種生物過程［19］，在正常情況下，TNF-α及IL-6均處于低水平，但在大量組織受到刺激后，以上炎癥介質水平將異常升高，引起全身炎癥反應［20］。本研究結果提示等位基因G可能通過加重機體炎癥反應，促進ARC 的發生。但受限于研究條件與研究設計，本文并未對其中的具體作用機制進行研究，存在一定的局限性。

綜上所述，ARC病人TLR4基因rs7986790位點基因型分布與健康者間存在差異，rs7986790位點等位基因G可能通過促進炎癥反應，增加ARC患病風險。