微RNA-124-3p在潰瘍性結腸炎病人外周血中的表達及意義

吳春燕，汪曉燕，李炎

作者單位：武漢市蔡甸區人民醫院，a消化內科，b內分泌科，湖北 武漢430100

目前為止，潰瘍性結腸炎（UC）確切的發病機制尚不清楚［1-2］。因此，早期診斷UC疾病及其嚴重程度對及時有效地進行治療至關重要［3］。微RNA（miRNA）是一種長度為18～25個核苷酸的單鏈非編碼內源性RNA 分子，其主要功能是負調控編碼蛋白靶基因的mRNA穩定性，不僅影響癌癥的發生發展，而且在其他疾病的進展中也具有一些特殊的調控功能［4］。近年來證據表明，miRNA 在UC 中廣泛失調，可能參與UC 的發病機制，并在其診斷和治療方面發揮作用［5-6］。微RNA-124（miR-124）最初在小鼠中發現，后來被證明是一個高度保守的miRNA。微RNA-124-3p（miR-124-3p）是miR124 成員之一，位于染色體20q13.33，此前主要被表述為一個腫瘤抑制因子，隨后發現其在免疫功能調節中發揮作用，并參與調節各種炎癥反應［7］。miR-124-3p 的研究主要集中在癌癥發生與發展中的潛在影響方面，而對于UC的臨床研究了解較少。因此，本研究檢測了miR-124-3p 在UC病人外周血中的表達，旨在闡述miR-124-3p表達在UC 方面的臨床意義，為進一步理解UC 發病機制和開發新的治療手段開辟了一個新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為前瞻性研究，選擇121 例UC病人（UC組）和60例健康體檢者（對照組）作為研究對象。UC 組來源于2019 年8 月至2021 年8 月武漢市蔡甸區人民醫院消化科住院治療的病人，其中男性63例，女性58例；年齡范圍為20～78歲，中位年齡40歲；病情緩解期43例，活動期78例；病變為直腸的30例，左半結腸36例，廣泛結腸55例。所有UC病人均進行了臨床常規檢查、結腸鏡檢查及組織病理學評估，符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年·北京）》［8］中的診斷標準，就診前未接受過其他治療，臨床資料完善；排除合并其他炎性疾病和惡性腫瘤的病人及有肝腎功能障礙的病人。對照組來源于同期于我院進行健康體檢的個體，男性35例，女性25例，年齡范圍為27～76歲。兩組病人性別、年齡相比，均差異無統計學意義（χ2=0.64，P=0.426；t=1.15，P=0.253）。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞分離及總RNA 提取 抽取所有研究對象清晨空腹狀態下的靜脈血5 mL，收集在肝素抗凝管中，使用淋巴細胞分離液分離純化外周血單個核細胞，保存待測。使用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技有限公司，貨號10296028）按照說明書的步驟提取UC 病人和健康體檢者外周血單個核細胞中的總RNA，RNA 樣品的濃度和純度使用電泳和分光光度法測定，OD值1.8～2.0為合格。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-124-3p 表達水平 取檢測合格的RNA 樣品，使用miScript 逆轉錄試劑盒（上海聯碩寶為生物科技有限公司，貨號218161）進行cDNA 制備，然后使用miScript SYBR Green PCR Kit（上海賓智生物科技有限公司，貨號218075）在ABI 7900HT 熒光定量PCR系統上（美國ABI 公司）檢測miR-124-3p 的表達水平。qRT-PCR 反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40 個循環。以U6 作為內參基因，引物序列如下：miR-124-3p 正 向5"-CGGGTAGCAGGCTTCTGAGT-3"，miR-124-3p 反 向5"-AAACCCCTCTCTGTCGGTAGCT-3"；U6 正 向5"-CTTTGCCGCACGGCACA-3"，U6 反向5"-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3"，引物干粉由上海生工生物公司合成。每組實驗重復3 次，最后使用2-ΔΔCt公式計算miR-124-3p的表達水平。

1.2.3 C-反應蛋白（CRP）水平檢測 CRP 水平檢測使用酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，嚴格按照試劑盒（北京，貨號SEKH-0138）說明書的操作方法進行檢測。

1.2.4 UC病人嚴重程度分組 根據UC內鏡嚴重指數（UCEIS）對UC 病人受累腸段嚴重程度進行評分［9］，根據血管紋理、出血情況及糜爛潰瘍這3 個方面計算UCEIS 評分，血管正常為0分，血管紋理部分消失為1分，全部消失為2分；無出血為0分，黏膜出血為1分，腔內少量新鮮出血為2分，腔內多量出血，沖洗后滲血，黏膜新鮮滲血為3分；正常黏膜，無潰瘍為0 分，糜爛（黏膜表面黃白色平坦邊緣≤5 mm 小缺損）為1 分，淺潰瘍（＞5 mm 黏膜破損，或散在表淺潰瘍）為2分，深潰瘍（深鑿樣黏膜缺損，周邊輕度隆起）為3分。UC緩解期病人UCEIS評分為0～1分，活動期為2～8 分。根據改良梅奧（Mayo）評分對UC 病人臨床活動度進行評價［10］，癥狀緩解及輕度、中度、重度活動分別為0～2分、3～5分、6～10分、11～12分。

1.3 統計學方法本研究數據應用SPSS 22.0版本統計學軟件完成分析。計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；UC活動期病人外周血miR-124-3p表達水平與CRP水平的相關性采用Pearson法，與UCEIS 評分、改良Mayo 評分的相關性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-124-3p 及CRP 在UC 組和對照組外周血中的表達水平與對照組相比，UC組病人外周血中miR-124-3p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），CRP 水平顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 潰瘍性結腸炎（UC）病人121例和健康體檢者60例miR-124-3p、CRP表達水平的比較∕ ± s

表1 潰瘍性結腸炎（UC）病人121例和健康體檢者60例miR-124-3p、CRP表達水平的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應蛋白。

組別對照組UC組t值P值CRP∕（mg∕L）7.08±2.52 9.83±2.91 6.25＜0.001例數60 121 miR-124-3p 0.84±0.22 0.52±0.17 10.78＜0.001

2.2 miR-124-3p 及CRP 在UC 緩解期和活動期病人外周血中的表達水平與UC緩解期病人相比，活動期病人外周血中miR-124-3p的表達水平顯著降低（P＜0.05），CRP水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 潰瘍性結腸炎（UC）病人121例緩解期和活動期miR-124-3p、CRP表達水平的比較∕ ± s

表2 潰瘍性結腸炎（UC）病人121例緩解期和活動期miR-124-3p、CRP表達水平的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應蛋白。

病情程度緩解期活動期t值P值CRP∕（mg∕L）9.06±2.85 10.25±2.94 2.15 0.033例數43 78 miR-124-3p 0.67±0.22 0.44±0.14 7.02＜0.001

2.3 miR-124-3p 及CRP 在UC 不同病變范圍病人外周血中的表達水平UC 不同病變范圍病人miR-124-3p、CRP 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 潰瘍性結腸炎（UC）病人121例不同病變范圍miR-124-3p、CRP表達水平的比較∕ ± s

表3 潰瘍性結腸炎（UC）病人121例不同病變范圍miR-124-3p、CRP表達水平的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應蛋白。

病變范圍直腸左半結腸廣泛結腸F值P值CRP∕（mg∕L）10.85±3.08 9.24±2.63 9.65±2.99 2.69 0.072例數30 36 55 miR-124-3p 0.46±0.14 0.52±0.17 0.55±0.18 2.79 0.066

2.4 UC 不同臨床活動度病人外周血miR-124-3p、CRP 表達水平及UCEIS 評分、改良Mayo 評分的比較與UC 輕度活動病人相比，中度和重度活動病人外周血中miR-124-3p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），CRP 水平、UCEIS 評分及改良Mayo 評分顯著升高（P＜0.05）；與UC 中度活動病人相比，重度活動病人外周血中miR-124-3p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），CRP 水平、UCEIS 評分及改良Mayo 評分顯著升高（P＜0.05）。見表4。

表4 潰瘍性結腸炎（UC）不同活動期78例miR-124-3p、CRP表達水平及UCEIS評分、改良Mayo評分的比較∕ ± s

表4 潰瘍性結腸炎（UC）不同活動期78例miR-124-3p、CRP表達水平及UCEIS評分、改良Mayo評分的比較∕ ± s

注：miR-124-3p為微RNA-124-3p，CRP為C-反應蛋白，UCEIS評分為潰瘍性結腸炎內鏡嚴重指數評分，改良Mayo評分為改良梅奧評分。①與輕度相比，P＜0.05。②與中度相比，P＜0.05。

臨床活動度輕度中度重度F值P值改良Mayo評分∕分3.98±0.95 7.70±1.64①11.53±0.46①②240.04＜0.001例數27 30 21 miR-124-3p 0.53±0.16 0.45±0.13①0.30±0.09①②16.01＜0.001 CRP∕（mg∕L）8.74±2.83 10.35±2.79①12.03±3.02①②7.43 0.001 UCEIS評分∕分3.03±0.90 4.82±1.51①5.97±1.82①②26.10＜0.001

2.5 UC 活動期病人外周血miR-124-3p 與CRP、UCEIS評分及改良Mayo評分的相關性相關性分析結果顯示，UC活動期78例外周血miR-124-3p表達水平與CRP、UCEIS評分及改良Mayo評分均呈負相關（r=-0.57，P＜0.05；r=-0.44，P＜0.05；r=-0.59，P＜0.05）。

3 討論

在過去的20 年里，對UC 復雜發病機制的更多了解引發了藥物開發的進步，如幾種生物制劑和小分子療法的開發，盡管治療選擇的增加是積極的，但對臨床UC 的療效有限，一旦確診難以治愈，并且與結直腸癌的高風險相關［11］。目前仍需要尋找UC潛在的治療靶點，以利于臨床早期評估病情嚴重程度，確定有效的治療方式。

先前的研究已經證明miRNA 在UC 病人中差異表達，并且在UC 的病理過程中具有重要作用。例如，miR-155 改善UC 病人的活動期腸道炎癥，miR-21 可緩解UC 腸道屏障功能受損［12］。UC 是一個嚴重的炎癥過程，不同的miRNA 在UC 的炎癥過程中發揮著不同的調節作用。miR-206 在UC 中的表達量顯著上調，在炎癥反應調節中發揮促炎因子的作用［13］。miR-505在UC中的表達量下調，其低表達與病人的病情嚴重程度和預后不良有關［14］。miR-219-5p在UC 小鼠結腸黏膜組織中下調，注射其慢病毒過表達載體可抑制促炎細胞因子的產生，減輕UC 小鼠的結腸損傷［15］。越來越多的證據表明，miR-124-3p 的表達異常與各種類型癌癥的惡性進展、耐藥甚至預后生存相關，對于某些疾病的早期診斷、治療和預后有重要價值［5］。前人關于miR-124-3p的研究主要集中在癌癥領域，例如，Wang 等［16］報道了miR-124-3p 在肝細胞癌中表達下調，與肝細胞癌的進展和轉移密切相關。而最近幾年研究表明，miR-124-3p 在免疫功能中發揮作用，并參與調節各種炎癥反應。Liang 等［17］在心肌缺血再灌注損傷的大鼠模型和H∕R 處理的人心肌細胞中發現miR-124-3p 顯著下調，可能調節H∕R 誘導的炎癥和細胞凋亡。Luo等［18］的研究中報道了miR-124-3p 與UC 相關，miR-124-3p 通過靶向調控LPS 誘導的結腸細胞中的STAT3 發揮作用，增強miR-124-3p 的表達可減少炎癥過程中細胞凋亡和ROS 的產生。基于以上文獻，我們的研究檢測了UC 病人和對照組外周血miR-124-3p的表達水平，研究顯示，與對照組相比，UC病人中miR-124-3p 的表達水平顯著降低，說明miR-124-3p 表達水平可能對UC 的發生過程產生一定的影響。

本研究中，UC 活動期病人外周血miR-124-3p表達水平較緩解期低，且UC 不同臨床活動度病人外周血miR-124-3p 表達水平由高至低依次為輕度、中度、重度，說明miR-124-3p 表達水平可能與UC 病人病情變化有關。大量研究證實，UCEIS評分、改良Mayo 評分是臨床常用評估UC 嚴重程度的工具，而CRP 是一種臨床常用的炎癥標志物，在各種其他疾病狀態下均可迅速升高，對于評估UC 病情嚴重程度具有較高的靈敏度，在預測是否需要結腸切除術方面具有重要作用。對于UC 病人來說，UCEIS 評分、改良Mayo評分和CRP水平在總體嚴重程度評分中擁有較高的權重［19-20］。本研究中CRP 水平在UC病人中水平升高，UC 活動期病人CRP 水平較緩解期高，UC 不同臨床活動度病人CRP 表達水平及UCEIS 評分、改良Mayo 評分由高至低依次為重度、中度、輕度，且相關分析結果顯示UC 活動期病人外周血miR-124-3p 表達水平與CRP、UCEIS 評分及改良Mayo評分均呈負相關，進一步說明miR-124-3p表達可能與UC 病變活動和嚴重程度有一定關系，且可能參與UC 的炎癥反應。此外，本研究通過分析UC 不同病變范圍病人miR-124-3p、CRP 表達水平，結果顯示miR-124-3p、CRP表達在UC不同病變范圍中的變化較小，提示檢測miR-124-3p、CRP水平對區分UC的發病部位幫助較小。

綜上所述，UC 病人外周血miR-124-3p 表達水平較低，miR-124-3p 表達水平與UC 病人CRP、UCEIS 評分及改良Mayo 評分密切相關，可能成為反映UC 病人病情的指標之一。但本研究存在一些局限性，樣本規模相對較小，使得在數據選擇和分析中容易產生偏倚，需要進一步加大規模驗證。