血清白細胞介素-35、乳酸脫氫酶在骨髓增生異常綜合征120例中的臨床意義

王寧，匡歆，赫寧寧

作者單位：青島市膠州中心醫(yī)院檢驗科，山東 青島266300

骨髓增生異常綜合征（MDS）是起源于造血干細胞的腫瘤性疾病，其主要特征是骨髓造血功能異常、血細胞發(fā)育異常，且高風險向急性髓系白血病（AML）轉(zhuǎn)化［1］。MDS 病情具有多樣性，且眾多病人病情危險程度不一，臨床常給予個體化治療以延緩病情進展為主［2］。因MDS 存在極大異質(zhì)性，盡管目前已推廣出眾多治療方案，仍有部分病人治療療效和生存時間存在顯著差異［3］。因此，臨床應探究與MDS 病人療效有關的指標，評估病人治療失敗風險。修訂的國際預后積分系統(tǒng)（IRSS-R）被認為是評估MDS 預后的金標準，但其評估標準是否適用于化療或靶向治療等病人依然未知，以此成為應用局限。研究指出，MDS 發(fā)病機制主要涉及造血前體細胞的特定分子缺陷，不同免疫途徑均參與其中，自身免疫異常和T細胞介導的免疫抑制被認為是MDS的主要特征［4］。白細胞介素（IL）-35 屬于Ⅰ型細胞因子受體，主要在細胞相互接觸時大量生成，可促進效應T細胞活化、成熟［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-35與免疫負向調(diào)節(jié)有關，可通過抑制輔助性T 細胞17（Th17）分化而產(chǎn)生免疫抑制作用［6］。韓冰等［7］研究發(fā)現(xiàn)，MDS 仍存在病態(tài)造血、原位溶血及細胞過度損害等病理反應。乳酸脫氫酶（LDH）是人體組織中細胞代謝酶，其活性增高常見于白血病、惡性腫瘤等疾病，尤其可反應細胞增殖、代謝異常，與骨髓原位溶血、紅細胞破壞等緊密相關［8］。由此推測，IL-35、LDH 可通過增強免疫抑制途徑和加速細胞損壞，促進MDS 病情進展，影響治療效果。本研究將分析血清IL-35、LDH 與MDS 病人治療效果的關系，評估MDS治療失敗風險，制定后續(xù)干預方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取青島市膠州中心醫(yī)院2019 年5 月至2020 年5 月收治的128 例MDS 病人作為研究對象。納入標準：①MDS 符合《骨髓增生異常綜合征中國診斷與治療指南（2019年版）》［9］中相關診斷；②伴有貧血相關癥狀，如乏力、疲倦等；③參照上述指南在醫(yī)院接受個體化治療，治療期間同步進行隨訪；④入院時預計生存周期＞6 個月。排除標準：①合并白血病或?qū)嶓w惡性腫瘤；②合并急性感染；③合并先天性免疫功能缺陷；④合并先天性造血干細胞功能障礙；⑤合并其他血液疾病；⑥合并自身免疫性疾病；⑦合并其他骨髓疾病；⑧長期接受激素治療者。剔除標準：①發(fā)生任何不良反應需停止用藥；②隨訪期間突發(fā)重大疾病需停止觀察；③隨訪期間全因死亡；④病人或其近親屬主動要求退出研究。本研究病人或其近親屬知情同意，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 設計調(diào)查問卷，統(tǒng)計病人臨床資料：年齡、性別（男∕女）、WHO 分型［MDS 伴單系發(fā)育異常（MDS-SLD）∕MDS 伴多系發(fā)育異常（MDSMLD）∕MDS 伴原始細胞過多-Ⅰ（MDS-EB-Ⅰ）］、WHO 分型預后積分系統(tǒng)（WPSS）［9］、IRSS-R 評分［9］、危險程度［較低危（IRSS-R≤3.5 分）∕較高危（IRSS-R＞3.5分）］［9］。

1.2.2 MDS 治療及預后評估方法 （1）治療方案：研究中120 例病人均參照《骨髓增生異常綜合征中國診斷與治療指南（2019 年版）》［9］在醫(yī)院接受個體化治療：對于較低危病人以改善造血，提高生活質(zhì)量為治療目標，包括成分輸血、造血生長因子、去鐵治療等，對于存在輸血依賴性貧血，且對細胞因子治療效果不佳病人可采用免疫調(diào)節(jié)劑治療，如來那度胺治療，28 d 為1 個療程。對于較高危病人以降低病情向AML 轉(zhuǎn)化風險，改善生存為治療目標，采用去甲基化藥物治療，如5-阿扎胞苷（AZA）、5-阿扎-2-脫氧胞苷（地西他濱）等藥物；AZA 治療：用法用量為皮下注射AZA（Celgene Europe BV，批號H20170238），75 mg·m-2·d-1）×7 d，28 d 為1 個療程。（2）療效評估［9］：治療6 個療程時參照指南中療效標準評估治療效果，分為完全緩解（CR）：原始細胞≤5%且所有細胞系均成熟，血紅蛋白（Hb）≥110 g∕L、血小板（PLT）≥100×109∕L、中性粒細胞絕對計數(shù)（ANC）≥1.0×109∕L、原始細胞為0；部分緩解（PR）：外周血絕對值持續(xù)≥2個月、其余條件達到CR標準但原始細胞較治療前僅減少≥50%，仍＞5%不考慮骨髓細胞增生程度；疾病穩(wěn)定（SD）：未達部分緩解最低標準但至少8周病情未進展；治療失敗（failure）：治療期間病死或病情進展，主要表現(xiàn)為血細胞進一步減少、骨髓原始細胞增高等。根據(jù)病人治療效果分為治療有效組（CR、PR、SD）和治療失敗組（Failure）。

1.3 研究相關實驗室指標檢測方法治療前，采集病人空腹外周靜脈血8 mL分別放置于兩支試管中，取其中一支試管采用全自動血細胞分析儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司，BH-5360）檢測全血白細胞（WBC）：參考值（4～10）×109∕L、ANC：參考值（1.8～6.3）×109∕L；取 另 一 支 試 管 以3 500 r∕min速率離心10 min 分離血清和血漿（離心半徑為10 cm），血漿中加入抗凝劑，采用全自動血細胞分析儀檢測血漿紅細胞（RBC）：參考值男（4.3～5.8）×1012∕L；女（3.8～5.1）×1012∕L、Hb：參考值男130～175 g∕L；女115～150 g∕L、PLT：參考值（125～350）×109∕L，采用連續(xù)檢測法測定血清LDH 水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-35水平，LDH參考為120～250 U∕L、IL-35正常值為3.3～200.0 ng∕L，試劑盒均購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.4 樣本量估算使用Kendall 粗略樣本量估算方法，樣本量為自變量的5～10倍，本研究以MDS病人治療效果作為因變量，納入的自變量包括一般資料（6項），檢測指標（7項），共計13項，考慮到10%的失訪病人，研究至少需納入72～143例病人，以2019年5月至2020年5月收治的128例MDS病人作為研究對象。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，采用例（%）表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗；采用Shapiro-Wilk 正態(tài)分布檢驗計量資料的正態(tài)性情況；符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較以獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（第25、75 百分位數(shù)）、即M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義；血清IL-35、LDH 與MDS病人治療效果的關系，采用logistic 回歸分析檢驗；繪制受試者操作特征（ROC）曲線，并計算曲線下面積（AUC），獲取血清IL-35、LDH預測MDS 病人治療失敗的最佳閾值；采用限制性立方樣條函數(shù)評估血清IL-35、LDH 與MDS 病人治療效果的OR值關系，采用樣條函數(shù)與logistic 回歸相結合的限制性立方樣條法分析自變量與因變量之間關系，以估血清IL-35、LDH最佳閾值為參考值，采用限制性立方樣條法分析血清IL-35、LDH 與MDS病人治療效果的劑量反應關系。

2 結果

2.1 MDS病人治療效果128例MDS病人，治療期間2 例要求退出研究，2 例因使用來拿度胺發(fā)生PLT減少，1例發(fā)生中性粒細胞減少癥，需停止用藥，3例失訪，共剔除8 例病人，以120 例病人為實際研究對象。120 例MDS 病人，于治療6 個療程時，CR 占12例（10.00%）、PR 占60 例（50.00%）、SD 占20 例（16.67%）、Failure 占28 例（23.33%）；治療失敗組占23.33%（28∕120），治療有效組占76.67%（92∕120）。

2.2 治療有效組和治療失敗組一般資料比較治療失敗組WPSS評分、IRSS-R均高于治療有效組，較高危病人占比多于治療有效組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩組其他資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 骨髓增生異常綜合征120例中治療有效組和治療失敗組一般資料比較

2.3 治療有效組和治療失敗組實驗室指標比較治療失敗組全血ANC，血漿Hb、PLT 低于治療有效組，血清IL-35、LDH表達量高于治療有效組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩組其他指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 骨髓增生異常綜合征120例中治療有效組和治療失敗組實驗室指標比較∕ ± s

表2 骨髓增生異常綜合征120例中治療有效組和治療失敗組實驗室指標比較∕ ± s

注：WBC為白細胞，ANC為中性粒細胞絕對計數(shù)，RBC為紅細胞，Hb為血紅蛋白，PLT為血小板，IL-35為白細胞介素-35，LDH為乳酸脫氫酶。

組別治療失敗組治療有效組t值P值LDH∕（U∕L）347.22±31.82 315.58±26.03 5.34＜0.001例數(shù)28 92 WBC∕（×109∕L）6.65±0.64 6.43±0.56 1.84 0.069 ANC∕（×109∕L）0.43±0.11 0.54±0.13 3.91＜0.001 RBC∕（×1012∕L）3.87±0.32 3.78±0.30 1.36 0.176 Hb∕（g∕L）85.61±5.31 89.34±6.44 2.78 0.006 PLT∕（×109∕L）82.62±3.72 85.80±4.47 3.43 0.001 IL-35∕（ng∕L）140.03±11.75 128.17±10.63 5.04＜0.001

2.4 各指標與MDS 病人治療效果關系的logistic回歸分析以MDS 病人治療效果作為因變量（1=治療失敗，0=治療有效），將差異有統(tǒng)計學意義的指標納入作為自變量，經(jīng)logistic 回歸分析顯示，MDS 病人治療失敗與全血ANC，血漿Hb、PLT 低表達，血清IL-35、LDH高表達有關（P＜0.05）。見表3。

表3 各指標與骨髓增生異常綜合征120例治療效果關系的logistic回歸分析

2.5 血清IL-35、LDH 聯(lián)合預測MDS 病人治療效果以MDS 病人治療效果作為狀態(tài)變量（1=治療失敗，0=治療有效），將血清IL-35、LDH 作為檢驗變量，繪制ROC 曲線圖發(fā)現(xiàn)，血清IL-35、LDH 單獨及聯(lián)合預測MDS 病人治療失敗風險的AUC 分別為0.77、0.79、0.83，當二者截斷值分別取129.70 ng∕L、324.28 U∕L時，可獲取最佳預測效能。見表4。

表4 血清IL-35、LDH聯(lián)合預測骨髓增生異常綜合征120例治療效果

2.6 血清IL-35、LDH 與MDS 病人治療效果的劑量反應關系以血清IL-35、LDH 最佳截斷值129.70 ng∕L、324.28 U∕L 為參考值，采用樣條函數(shù)與logistic 回歸相結合的限制性立方樣條法，分析血清IL-35、LDH 與MDS 病人治療效果的劑量反應關系。血清IL-35、LDH 連續(xù)變化與MDS 病人治療失敗的關聯(lián)強度成線性劑量反應關系（P＜0.05）；血清IL-35、LDH 與MDS 病人治療失敗呈顯著正相關，當血清IL-35＞129.70 ng∕L、血清LDH＞324.28 U∕L 時，MDS病人治療失敗風險隨血清IL-35、LDH升高而升高。

3 討論

文獻指出，MDS 病人自然病程和危險層級差異有統(tǒng)計學意義，治療宜個體化，以改善自然病程、血液學質(zhì)量及生存質(zhì)量為主［10］。然而目前MDS 治療方案存在多樣性，不同病情病人所制定治療方案不同，整體療效難以提升，這也導致MDS 病人預后產(chǎn)生一定差異［11］。為評估MDS 病人整體治療效果，鄭麗坤等［12］研究發(fā)現(xiàn)，80 例MDS 病人治療24 個月時疾病進展率高達31.25%。但本研究中，120 例MDS病人治療失敗率約23.33%，與上述研究不同原因在于，病人危險層級、觀察周期等差異，但上述研究數(shù)據(jù)均表明MDS 的整體治療收益有待提高，探究與MDS病人治療效果有關的指標十分必要。

研究指出，自身免疫異常參與骨髓造血抑制與疾病進展，其中Tregs 細胞在維持免疫耐受、調(diào)節(jié)T細胞穩(wěn)態(tài)等方面具有重要作用，能夠抑制免疫效應細胞對異常發(fā)育克隆細胞的清除能力，促進MDS 病情進展［13］。IL-35 為IL-12 家族成員，與其他家族成員不同，IL-35 是由Tregs 分泌的免疫抑制性細胞因子，能夠抑制T 細胞增殖及向Th1、Th17 細胞分化，誘導Tregs 增殖，以發(fā)揮免疫抑制作用［14］。除此之外，IL-35 能夠誘導新型Tregs（即iTR35）生成，即使無Tregs 存在，iTR35 仍可發(fā)揮強大免疫抑制效應，加重疾病進展［15］。近年來，Ye 等［16］研究證實，高濃度的IL-35可有效抑制T細胞增殖，增強免疫抑制作用。LDH 為糖代謝中重要酶系之一，廣泛存在于器官和骨骼肌等組織中。早在2011 年，Kim 等［17］研究證實，LDH 與白血病病情進展有關，通過參與RBC、PLT 損傷而增加出血風險，加重白血病病情。近年來研究發(fā)現(xiàn)，LDH 與MDS 發(fā)病風險有關，可進一步引起細胞損傷，從而加重MDS病情［18］。

本研究中，治療失敗組血清IL-35、LDH 表達均高于治療有效組，也進一步證實血清IL-35、LDH 與MDS 病情進展有關。與此同時，治療失敗組較高危病人居多，該結果也表明較高危病人血清IL-35、LDH水平普遍較高。這可能與血清IL-35、LDH參與MDS病情進展有關。結合上述研究結果認為，IL-35通過增強免疫抑制作用，導致異常發(fā)育克隆細胞增生，從而導致MDS 病情進展，增加病情危險程度。LDH 介導RBC、PLT 等細胞損傷參與MDS 的發(fā)病過程，增加病情危險程度。這也成為較高危病人治療失敗普遍較多的主要原因。為進一步明確血清IL-35、LDH 與MDS 的關系，經(jīng)logistics 回歸分析顯示，MDS病人治療失敗與血清IL-35、LDH高表達有關。

目前認為IL-35、LDH 通過以下機制參與MDS進展，影響治療效果：（1）IL-35：IL-35 可通過抑制細胞毒性T 細胞過度增殖及CD4+細胞分化為Th 或Th17 效應細胞，發(fā)揮免疫抑制作用，從而加速異常發(fā)育細胞克隆和血細胞損傷，以此加重MDS 危險層級，最終增加治療難度［19］。IL-35與Treg可相互上調(diào)表達，誘導T 細胞轉(zhuǎn)化為iTR35 細胞，構成機體免疫調(diào)控網(wǎng)絡，進一步加重免疫抑制，加重MDS 病人細胞損傷，從而增加治療難度［20］。Egwuagu 等［21］研究顯示，IL-35 可協(xié)同Treg 發(fā)揮免疫抑制作用，從而加重相關疾病病情。（2）LDH：LDH 升高與細胞結構和功能改變有關，LDH 在RBC 紅含量比正常血清中活性高出1 000 余倍，LDH 升高可導致RBC 過度損傷，從而加重MDS 病情進展［22］；除此之外，LDH 通過糖酵解可產(chǎn)生大量乳酸，而乳酸可通過促進異常發(fā)育細胞增殖、轉(zhuǎn)移，從而加速MDS 病人骨髓細胞損傷，利于病情惡性發(fā)展，增加臨床治療難度［23］。為明確LDH 與MDS 病人預后的關系，陳春平等［24］研究發(fā)現(xiàn)，血清LDH高表達可作為MDS病人病死的危險因素。由此可見，血清LDH 高表達一定程度上增加MDS病人治療失敗風險。

本研究在最后通過繪制ROC 曲線獲取血清IL-35、LDH 預測MDS 病人治療失敗的最佳閾值，結果顯示，當二者截斷值分別取129.70 ng∕L、324.28 U∕L 時，在預測MDD 治療失敗時可獲取最佳預測效能，由此認為，臨床在預測MDS 治療效果時，不僅可采用ANC、Hb、PLT 等指標，仍可將血清IL-35、LDH水平作為參考，以提高預測效能。然而本研究中，血清IL-35、LDH 預測MDS 病人治療失敗的靈敏度偏高，特異度偏低，這是由于IL-35 屬于天然免疫和適應性免疫反應中重要細胞因子，在MDS 中免疫反應可有效激活IL-35 導致其水平升高，這也是導致其靈敏度偏高的原因。而LDH 是機體損傷的重要標志物，機體幾乎所有臟器損傷均可導致LDH 升高，在MDS 中，骨髓細胞損傷導致造血功能和免疫功能等多系統(tǒng)功能障礙，這是造成LDH 靈敏度偏高的原因之一。此外，本研究為明確血清IL-35、LDH與MDS 病人治療效果的關系，采用限制性立方樣條分析顯示，血清IL-35、LDH 與MDS 病人治療失敗風險呈線性劑量反應關系，由此可見，臨床在治療MDS 前可考慮優(yōu)先獲取血清IL-35、LDH 最佳閾值，評估MDS 病人治療失敗風險，從而制定更加有效的干預方案，以改善治療預后。

本研究雖證實血清IL-35、LDH 與MDS 病人治療效果的關系，但由于觀察周期較短，尚未針對血清IL-35、LDH 實施針對性干預，并觀察病人治療效果。與此同時，本研究為單中心研究，能夠提供的MDS 樣本量有限，這也導致本研究結果一定程度上與后期研究產(chǎn)生差異，此為本研究的局限。今后研究將聯(lián)合多中心開展，擴增樣本量，繼續(xù)延長隨訪周期，將血清IL-35、LDH 作為MDS 病人治療靶點之一，進一步評估病人治療效果，為探究MDS 治療方案提供新的參考。

綜上所述，MDS 治療失敗與血清IL-35、LDH 高表達有關，血清IL-35、LDH 高表達與MDS 病人治療失敗風險呈線性劑量反應關系，臨床中或可以血清IL-35、LDH 作為MDS 的潛在治療靶點，通過改善血清IL-35、LDH 水平，延緩MDS 病情進展，盡可能降低治療失敗風險。