紫草素調(diào)控Hippo信號(hào)通路抑制鼻咽癌細(xì)胞株生物學(xué)功能及其機(jī)制研究

曹華琳，尹昕，梁天嵩

作者單位：1南陽市中心醫(yī)院耳鼻喉科，河南 南陽473000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科，河南 鄭州450000

鼻咽癌（NPC）是一種罕見的頭頸癌，位于鼻咽部上皮層，居我國(guó)頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率之首［1］，具有典型的地域性和種族分布性，多見于中國(guó)南部和東南亞地區(qū)［2］。目前，NPC 治療的主要策略為放射療法［3］，但易導(dǎo)致NPC 局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，病人5年生存率也因此不足60%［4］，積極探索NPC 侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并開發(fā)新型治療藥物，可能是提高病人生存率的有效手段。紫草素廣泛用于治療燒傷、麻疹、癰和黃斑疹［5］，據(jù)報(bào)道，其可通過多種途徑抑制NPC發(fā)展［6］。研究發(fā)現(xiàn)，Hippo通路有助于順鉑耐藥誘導(dǎo)的NPC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)而利于癌癥侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［7］，但關(guān)于紫草素是否可通過Hippo 信號(hào)通路作用NPC 細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道較少，故本研究于2021年1—12月以人鼻咽癌細(xì)胞（CNE2細(xì)胞）為研究載體并利用不同濃度紫草素加以作用，探討其抗CNE2效果及可能機(jī)制，以期為NPC 干預(yù)機(jī)制及治療藥物選擇提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2 購自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑和儀器 紫草素（純度98%）（南京道斯夫生物科技有限公司，批號(hào)517-89-5）；Matrigel 基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司，批號(hào)356234）；AnnexinV-FITC∕PI流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技公司，批號(hào)KGA106）；胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)10270）；腫瘤抑制激酶1∕2抗體（LATS1∕2）（武漢艾美捷生物科技有限公司，批號(hào)ABP51705）；p-LATSA1∕2 抗體（bs-7913R）及波形蛋白（Vim）抗體（bs-8533R）購自北京博奧森生物科技有限公司；yes相關(guān)蛋白1（YAP1）抗體（批號(hào)ab52771）、p-YAP1抗體（批號(hào)ab76252）、具有PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活子（TAZ）抗體（批號(hào)ab176396）、N-鈣黏蛋白（N-cad）抗體（批號(hào)ab76011）、E-鈣黏蛋白（E-cad）抗體（批號(hào)ab227639）購自美國(guó)Abcam公司；p-TAZ抗體（批號(hào)sc-17610）購自細(xì)胞生物科技上海股份有限公司；550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國(guó)Bio-Rad 公司；FluorChem HD2 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI 1640 完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）復(fù)蘇CNE2 細(xì)胞，以1×105個(gè)∕毫升密度接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳及飽和濕度環(huán)境條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)即進(jìn)行傳代，傳代2～3次。

1.2.2 CCK8 法檢測(cè)紫草素對(duì)CNE2 細(xì)胞存活率的影響 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，配制RPMI 1640 條件培養(yǎng)液（含0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg∕L 紫草素），分別重懸細(xì)胞，并以5×103個(gè)∕毫升密度接種200 μL 細(xì)胞懸液于96 孔板中，相應(yīng)濃度各設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，直接加入20 μL CCK8試劑于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（OD）值，細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD 值∕對(duì)照組OD 值×100%（實(shí)驗(yàn)組指含有紫草素的實(shí)驗(yàn)孔，對(duì)照組不含紫草素的對(duì)照孔），重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，RPMI 1640 條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，1 000 r∕min 離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，70%乙醇-PBS溶液4 ℃固定過夜，PBS洗滌2～3 次，結(jié)合緩沖液重懸，5 μL Annexin V-FITC 溶液、5 μL PI溶液避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，重復(fù)3次。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成能力 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，RPMI 條件培養(yǎng)液重懸，并以每孔100 個(gè)細(xì)胞的密度接種在6 孔板中，對(duì)應(yīng)培養(yǎng)14 d，至肉眼可見的細(xì)胞克隆后終止培養(yǎng)，冷4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并利用ImageJ計(jì)算菌落（超過50個(gè)細(xì)胞）。

1.2.5 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，RPMI完全培養(yǎng)液重懸，以2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。待培養(yǎng)至匯合，10 μL塑料移液槍頭作垂直細(xì)胞面劃痕，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，拍照記錄劃痕；后利用RPMI 1640 條件培養(yǎng)液（不含胎牛血清）培養(yǎng)48 h，拍照記錄劃痕，ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度變化，計(jì)算劃痕愈合率即（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）∕0 h劃痕寬度×100%，重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Matrigel基質(zhì)膠涂布上腔室，4 ℃下干燥，RPMI 1640條件培養(yǎng)液（不含胎牛血清）重懸的細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種200 μL至Transwell 24孔板上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的對(duì)應(yīng)條件培養(yǎng)液，48 h后棄去培養(yǎng)液，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，擦除過濾器上層細(xì)胞，鏡下觀察底部細(xì)胞并計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。

1.2.7 RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)YAP1、TAZ mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，RPMI 1640 條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，Trizol試劑提取紫草素各濃度下細(xì)胞總RNA，檢測(cè)其濃度及純度可用后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。制備RT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 34 s 40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，送至華大基因合成。引物序列：YAP1正向5"-ACCCACAGCTCAGCATCTT C-3"，反向引物5"-GCTGTGACGTTCATCTGGGA-3"；TAZ 正 向 5"-ACCCGC GAGTACAACCTTCTT-3"，反向5"-TATCGTCATCCATGGCGAACT-3"；β-actin 正向5"-CCCACACTGTGCCCATCTAC-3"，反 向5"-GGAACCGCTCATT GCCAATG-3"。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)情況 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，RPMI 1640 條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞沉淀，RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，取約50 μg 總蛋白上樣，10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗（均1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，二抗（1∶8 000 稀釋）室溫孵育1 h，洗膜，HRP-ECL 法顯影，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光，Image J 分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)量結(jié)果均以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)CNE2 細(xì)胞增殖、集落形成能力及CNE2 細(xì)胞凋亡的影響CNE2 細(xì)胞存活率隨紫草素濃度增大而降低（P＜0.05），集落形成數(shù)隨紫草素作用濃度增大而減少（P＜0.05）。CNE2 細(xì)胞凋亡率隨紫草素濃度增大而升高（P＜0.05）。見表1，圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)紫草素各濃度下CNE2細(xì)胞凋亡情況

表1 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞存活率比較∕ ± s

表1 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞存活率比較∕ ± s

注：①與0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。

紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值集落形成數(shù)∕個(gè)514.67±25.81 452.33±22.72①308.33±22.12①②173.67±13.65①②③85.33±13.05①②③④242.50＜0.001重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3細(xì)胞存活率∕%100.00 92.70±5.92①81.75±3.83①②54.93±3.89①②③33.89±2.14①②③④274.49＜0.001細(xì)胞凋亡率∕%0.97±0.29 7.97±1.14①19.91±3.21①②42.67±5.27①②③62.31±5.50①②③④138.90＜0.001

2.2 紫草素對(duì)CNE2 細(xì)胞遷移能力的影響CNE2細(xì)胞劃痕愈合率隨紫草素作用濃度增大而降低（P＜0.05）。見圖2，表2。

圖2 各濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞遷移情況

表2 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2侵襲細(xì)胞數(shù)比較∕ ± s

表2 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2侵襲細(xì)胞數(shù)比較∕ ± s

注：①與0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。

劃痕愈合率∕%88.58±3.40 69.91±3.03①53.61±3.21①②30.32±1.68①②③18.31±1.42①②③④341.35＜0.001紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3侵襲細(xì)胞數(shù)∕個(gè)233.67±15.01 195.33±18.15①153.33±10.02①②92.67±6.66①②③52.33±6.03①②③④111.05＜0.001

2.3 紫草素對(duì)CNE2 細(xì)胞侵襲能力的影響CNE2侵襲細(xì)胞數(shù)隨紫草素作用濃度增大而減少（P＜0.05）。見表2。

2.4 紫草素對(duì)CNE2 細(xì)胞YAP1、TAZ mRNA 表達(dá)的影響CNE2細(xì)胞YAP1、TAZ mRNA相對(duì)表達(dá)水平均隨紫草素作用濃度增大而降低（P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞YAP1、TAZ mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較∕ ± s

表3 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞YAP1、TAZ mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較∕ ± s

注：YAP1為yes相關(guān)蛋白1，TAZ 為具有PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活子。①與0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L 紫草素比較，P＜0.05。

TAZ 1.00±0.01 0.91±0.05①0.76±0.04①②0.54±0.04①②③0.30±0.02①②③④325.89＜0.001紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 YAP1 1.01±0.02 0.93±0.02①0.81±0.03①②0.65±0.03①②③0.41±0.02①②③④285.60＜0.001

2.5 紫草素對(duì)Hippo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響YAP1、TAZ、N-cad 及Vim 蛋白相對(duì)表達(dá)水平隨紫草素作用濃度增大而降低；p-YAP1、p-TAZ 及Ecad 蛋白相對(duì)表達(dá)水平隨紫草素作用濃度增大而升高。見圖3，表4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞相關(guān)蛋白條帶圖

表4 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞YAP1等蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較∕ ± s

表4 不同濃度紫草素培養(yǎng)下CNE2細(xì)胞YAP1等蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較∕ ± s

注：YAP1為yes相關(guān)蛋白1，p-YAP1為磷酸化yes相關(guān)蛋白1，TAZ為具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活子，p-TAZ為磷酸化具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活子，N-cad為N-鈣黏蛋白，Vim為波形蛋白，E-cad為E-鈣黏蛋白。①與0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。②與2.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。③與4.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。④與8.0 mg∕L紫草素比較，P＜0.05。

E-cad 0.15±0.02 0.28±0.02①0.36±0.02①②0.56±0.03①②③0.71±0.03①②③④249.35＜0.001紫草素濃度0 mg∕L 2.0 mg∕L 4.0 mg∕L 8.0 mg∕L 16.0 mg∕L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 YAP1 0.68±0.04 0.56±0.03①0.45±0.03①②0.31±0.03①②③0.18±0.02①②③④124.88＜0.001 p-YAP1 0.16±0.02 0.22±0.02①0.29±0.02①②0.36±0.02①②③0.48±0.03①②③④93.12＜0.001 TAZ 0.51±0.03 0.44±0.02①0.30±0.03①②0.24±0.02①②③0.16±0.02①②③④103.00＜0.001 p-TAZ 0.17±0.02 0.23±0.02①0.28±0.03①②0.44±0.03①②③0.52±0.03①②③④92.44＜0.001 N-cad 0.64±0.03 0.53±0.03①0.38±0.02①②0.32±0.02①②③0.23±0.01①②③④150.28＜0.001 Vim 0.50±0.02 0.46±0.01①0.34±0.02①②0.19±0.02①②③0.09±0.01①②③④327.11＜0.001

3 討論

紫草素是一種萘醌色素，為紫草主要生物活性成分之一，對(duì)多種類型腫瘤具有抗癌作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)，其可以時(shí)間和劑量依賴性方式顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的活性并促進(jìn)其凋亡［9］，并可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及有氧糖酵解途徑發(fā)揮抗NPC 作用［6，10］。鼻咽部位隱匿，多數(shù)病人在確診時(shí)已出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，抗凋亡特性及腫瘤細(xì)胞向周圍組織和遠(yuǎn)處器官的侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征［11-12］，本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可顯著抑制CNE2細(xì)胞的增殖活性、集落形成、遷移及侵襲能力，并可誘導(dǎo)其凋亡，且呈劑量依賴性，提示紫草素可以劑量依賴性方式抑制CNE2 癌細(xì)胞的惡性發(fā)展，可能是改善NPC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后的潛在藥物。

EMT 已被證明是介導(dǎo)NPC 轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，此過程中上皮性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型，細(xì)胞形態(tài)改變、上皮細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞間黏附中斷、遷移和侵襲能力增強(qiáng)［13］。E-cad 是上皮細(xì)胞中的特征性分子標(biāo)志，位于黏附連接處和基底外側(cè)質(zhì)膜上，Vim 和N-cad 則主要在間充質(zhì)來源的細(xì)胞中表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞侵襲密切相關(guān)［14］，抑制NPC 細(xì)胞中EMT 可降 低Vim 和N-cad 表達(dá)，上調(diào)E-cad 水 平并來抑制NPC 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移［15-16］。Mo 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可逆轉(zhuǎn)EMT，抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲；Li、Zeng［18］研究結(jié)果顯示，紫草素可下調(diào)EMT標(biāo)志蛋白N-cad、Vim 水平，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)，抑制肝細(xì)胞癌的惡性生物學(xué)行為，包括增殖、抗凋亡、遷移及侵襲。本研究經(jīng)不同濃度紫草素作用后發(fā)現(xiàn)，CNE2 細(xì)胞中N-cad 及Vim 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，E-cad 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性，提示紫草素可能通過減少上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞極性及細(xì)胞間黏附能力恢復(fù)，抑制EMT 進(jìn)展，進(jìn)而抑制CNE2 細(xì)胞遷移及侵襲。

Hippo 通路控制組織穩(wěn)態(tài)，包括器官大小、細(xì)胞增殖和凋亡，YAP 和TAZ 是該通路中的關(guān)鍵蛋白，在許多腫瘤中過度表達(dá)［19］。研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞中增加的YAP 及TAZ 可破壞細(xì)胞間連接，促進(jìn)間充質(zhì)基因表達(dá)，并增強(qiáng)EMT 相關(guān)的形態(tài)變化［20］，Hippo∕YAP∕TAZ 信號(hào)通路可通過調(diào)節(jié)EMT 促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲［21］。在沒有活性激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的情況下，YAP1 和TAZ 蛋白以其未磷酸化的形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并充當(dāng)轉(zhuǎn)錄輔助因子，并結(jié)合TEA 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族的成員并促進(jìn)促增殖和抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄［22］；Hippo 激酶存在時(shí)，YAP1 和TAZ 被上游信號(hào)磷酸化，p-YAP 和p-TAZ 在細(xì)胞質(zhì)中積累并被定向降解［23］。據(jù)報(bào)道，紫草素可依賴于Hippo 通路的活性，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞葡萄糖代謝，發(fā)揮腫瘤抑制作用［24］，但關(guān)于紫草素介導(dǎo)Hippo信號(hào)通路調(diào)節(jié)EMT過程而發(fā)揮抗NPC 作用的相關(guān)研究較少。本研究經(jīng)分子實(shí)驗(yàn)分析紫草素可能通過減少YAP1 及TAZ 的核轉(zhuǎn)移，降低與TEA 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族的成員結(jié)合，促進(jìn)兩者在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的積累并通過定向降解，抑制癌細(xì)胞惡性生物學(xué)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮抗EMT及抗增殖作用。

綜上所述，紫草素可抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2惡性生物學(xué)功能，其作用機(jī)制可能與抑制Hippo 信號(hào)通路中核心下游信號(hào)因子YAP1、TAZ蛋白表達(dá)并抑制EMT進(jìn)展有關(guān)。