碳、氮營養對2 株茶菌核心菌株生長和產酸的影響

◎ 唐 倩，劉斌杰

（1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.三明醫學科技職業學院，福建 三明 365000）

茶菌，又名康普茶，是起源于中國的一種發酵茶飲料。傳統的茶菌以紅茶和白糖為主要原料，經過酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的混合發酵而制成[1]。用于制作茶菌的原料（如不同茶葉、不同糖類）是影響茶菌風味、品質和生理功能的決定性因素之一[2]。發酵原料所提供的碳、氮營養不僅是茶菌微生物生長所必需的營養因子，同時是影響發酵微生物菌株互作關系和菌群動態的重要因素[3]。在碳源營養方面，李璐璐[4]通過比較不同碳源物質對茶菌發酵的影響，發現10%葡萄糖作為碳源時發酵液的pH 值下降最快；添加無機氮源對發酵液pH 值和總酸的變化沒有顯著影響。BRUNA 等[5]發現以綠茶為發酵基質制備茶菌，發酵液乙酸產量和抗高血壓活性值較高，而pH 值和乙醇值較低；以紅茶為發酵基質，發酵液總多酚含量較高；以馬黛茶為發酵基質，發酵液pH 值較高而抗高血壓活性值較低。CAMILA 等[6]分析碳源成分對不同酵母菌株的影響，發現真貝釀酒酵母（Saccharomyces eubayanus）在不同碳源的培養條件下生長速度不同，葡萄糖和蔗糖的混合有利于菌株的生長。這些研究大多分析不同營養物質對茶菌發酵液成分和功能的影響，對發酵菌株生長和代謝的作用研究很少。茶菌發酵過程中，微生物所需氮素營養主要來源于茶葉或其他植物原料。由于植物含氮物質豐富，種類各異，和碳源營養相比，有關氮源營養對茶菌發酵液和發酵菌株的影響，研究更為缺乏。

布魯塞爾酒香酵母和葡萄糖醋桿菌是茶菌發酵的核心菌株[7-9]。本研究分析碳、氮營養對布魯塞爾酒香酵母和葡萄糖醋桿菌單獨培養條件下菌株生長、發酵液pH 值和酸度的影響，為進一步研究兩菌株的互作關系，以及利用兩菌株構建人工混合菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

酵母菌菌株Q3（布魯塞爾酒香酵母Brettanomyces bruxellensis）和醋酸菌菌株Q4（葡萄糖醋桿菌Komagataeibacter rhaeticus）均為前期從紅茶菌中分離得到的菌株[10-11]，保藏于中國典型培養物菌種保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）。

1.2 培養基和試劑

酵母菌培養基、醋酸菌培養基和紅茶糖水液體培養基參照汪鵬輝等[11]的配方和方法。酵母氮源基礎培養基，自配[無氨基和硫酸銨酸酵母氮源（Yeast Nitrogen Base，YNB）6.7 g·L-1，葡萄糖35 g·L-1，配制10×YNB 基礎母液，0.22 μm 濾膜過濾除菌，置于2～8 ℃保存]。紅茶，福建省福州市好茗天茶葉有限公司；硝酸鉀、亞硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、無水葡萄糖、無水乙醇、碳酸鈣和氫氧化鈉（分析純），西隴化工股份有限公司；乳糖、半乳糖、麥芽糖、酵母浸膏和瓊脂，國藥集團化學試劑有限公司；果糖、纖維二糖，上海麥克林生化科技有限公司；YNB 培養基（基礎母液），上海生工生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化及培養條件

保藏于4 ℃條件下的菌株Q3 和Q4，無菌操作將菌株Q3 轉接到酵母菌培養基、菌株Q4 轉接到醋酸菌培養基，置于28 ℃恒溫下活化培養2～3 d。后挑取兩菌株單菌落分別接種至酵母菌液體培養基和醋酸菌液體培養基中，于28 ℃ 180 r·min-1培養48 h。隨后，參照汪鵬輝等[11]的方法進行菌株Q3 和Q4 的單獨培養。

1.3.2 碳源對菌株Q3、Q4 生長的產酸的影響

以未接菌的紅茶糖水培養液作為對照組，將對照組中的白糖分別換成質量分數為3.5%的不同碳源物質（纖維二糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖），各取150 mL 不同碳源的培養液分裝于250 mL 的錐形瓶中，冷卻至室溫，分別接入活化的菌株Q3 和Q4，置于28 ℃恒溫靜置培養12 d。培養過程中，每隔2 d取一次樣，測定發酵液OD600值（表征菌株生長情況）、pH 值和總酸含量。每組試驗設置3 個重復，每份樣品測定3 次取平均值。

1.3.3 氮源對菌株Q3、Q4 生長和產酸的影響

以未接菌的YNB 培養液作對照組，在YNB 培養液中分別加入質量分數為0.5%的不同氮源物質（茶氨酸、谷氨酸、硝酸鉀、亞硝酸鈉、氯化銨和硫酸銨），各取150 mL YNB 培養液分裝于250 mL 的錐形瓶中，冷卻至室溫，分別接入活化的菌株Q3 和Q4，于28 ℃恒溫靜置培養12 d。在培養過程中，每隔2 d 取一次樣，測定發酵液OD600值（表征菌株生長情況）、pH 值和總酸含量。每組試驗設置3 個重復，每份樣品測定3 次取平均值。

1.4 測定方法

（1）OD600測定方法。參考汪鵬輝等[11]的測定方法，使用紫外可見光分光光度計，在波長600 nm 下測定菌液的OD600[11]。

（2）pH 的測定。用Starter 2100 pH 計測定發酵液的pH 值。

（3）總酸的測定。參照《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》（GB/T 12456—2021）的方法操作，采用氫氧化鈉滴定法測定總酸含量。

1.5 數據分析

數據用SPSS 19.0 軟件進行方差分析，采用Origin 2021 作圖。

2 結果與分析

2.1 碳源對菌株Q3 生長和產酸的影響

2.1.1 碳源對菌株Q3 生長的影響

由圖1 可知，供試的7 種碳源物質均能促進菌株Q3 的生長，但促進作用的程度存在差異。添加乳糖和半乳糖為碳源時，菌株Q3 生長速度較為緩慢。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖為碳源時，菌株Q3的生長趨勢一致。菌株Q3 的生長速度總體表現為果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞纖維二糖＞半乳糖＞乳糖。

圖1 碳源物質對菌株Q3 單獨培養OD600 的影響圖

2.1.2 碳源對菌株Q3 發酵液pH 值的影響

由圖2 可知，在發酵0～2 d 時，不同碳源營養的菌株發酵液pH 值下降趨勢較明顯。發酵6～12 d，以乳糖為碳源的發酵液pH 值趨于穩定，維持在4.75～4.80。隨著培養時間的延長，以其他糖類為碳源的發酵液pH 值持續下降。培養至12 d，除乳糖外，其他糖類的發酵液pH 值在4.20～4.40，差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 碳源物質對菌株Q3 單獨培養pH 值的影響圖

2.1.3 碳源對菌株Q3 發酵液總酸的影響

由圖3 可知，除乳糖外，其他糖類為碳源的菌株Q3 發酵液酸度均隨發酵時間延長逐漸上升。發酵12 d后，以乳糖為碳源的菌株發酵液總酸含量為0.28 g·L-1，與對照組差異不顯著（P＞0.05）；其他糖類為碳源的發酵液總酸濃度在1.00～1.20 g·L-1，與對照相比差異極極顯著（P＜0.001）。

圖3 碳源物質對菌株Q3 單獨培養總酸的影響圖

2.2 碳源對菌株Q4 生長和產酸的影響

2.2.1 碳源對菌株Q4 生長的影響

由圖4 可知，菌株Q4 在葡萄糖為碳源的培養基中生長迅速，培養至6 d 時發酵液OD600達到最大值0.46，隨后，OD600值急劇下降，培養12 d 時發酵液OD600值為0.18。與葡萄糖相比，菌株Q4 在其他6 種碳源的培養基中培養2 d 后生長較為緩慢，菌體濃度的變化趨勢相似，均大體呈上升態勢，OD600值沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖4 碳源物質對菌株Q4 單獨培養OD600 的影響圖

2.2.2 碳源對菌株Q4 發酵液pH 值的影響

由圖5 可知，菌株Q4 在不同碳源營養的培養液中發酵后，發酵液pH 值隨發酵時間的延長呈現下降的趨勢。其中，以葡萄糖為碳源的發酵液pH 值下降快，與對照和其他碳源的發酵液相比差異極極顯著（P＜0.001）。

圖5 碳源物質對菌株Q4 單獨培養pH 的影響圖

2.2.3 碳源對菌株Q4 發酵液總酸的影響

由圖6 可知，培養4 d 后，以葡萄糖為碳源的菌株Q4 發酵液總酸含量急劇上升，培養到12 d，發酵液總酸含量達到4.94 g·L-1，與對照和其他碳源的發酵液相比差異極極顯著（P＜0.001）。其余6 種碳源的菌株發酵液總酸含量低于0.50 g·L-1，與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 碳源物質對菌株Q4 單獨培養總酸的影響圖

2.3 氮源對菌株Q3 生長和產酸的影響

2.3.1 氮源對菌株Q3 生長的影響

由圖7 可知，菌株Q3 能夠在以硫酸銨、氯化銨、茶氨酸、硝酸鉀和谷氨酸為氮源的培養基中生長，但在以亞硝酸鈉為氮源的培養基中幾乎不生長。硫酸銨、氯化銨和茶氨酸為氮源能明顯促進菌株Q3 生長；特別是兩種銨鹽，與其他氮源相比對菌株Q3 生長促進作用極極顯著（P＜0.001）。

圖7 氮源物質對菌株Q3 單獨培養OD600 的影響圖

2.3.2 氮源對菌株Q3 發酵液pH 值的影響

由圖8 可知，添加亞硝酸鈉為氮源時，pH 值高于對照組；其他5 種氮源發酵液的pH 值低于對照組。添加亞硝酸鈉為氮源時，菌株Q3 發酵液pH 值呈現緩慢上升的趨勢；以谷氨酸為氮源時，發酵液的pH 值變化不明顯；添加其他4 種氮源物質發酵液pH 值逐漸下降。與對照組相比較，以兩種銨鹽為氮源，發酵液pH 值下降最明顯（P＜0.001）。

圖8 氮源物質對菌株Q3 單獨培養pH 的影響圖

2.3.3 氮源對菌株Q3 發酵液總酸的影響

由圖9 可知，除亞硝酸鈉外，添加其他氮源物質的菌株Q3 發酵液總酸含量呈現上升的趨勢。發酵12 d后，發酵液總酸量表現為谷氨酸＞氯化銨＞硫酸銨＞茶氨酸＞硝酸鉀＞亞硝酸鈉。

圖9 氮源物質對菌株Q3 單獨培養總酸的影響圖

2.4 氮源對菌株Q4 生長和產酸的影響

2.4.1 氮源對菌株Q4 生長的影響

由圖10 可知，菌株Q4 在以茶氨酸為氮源的培養基中生長迅速，12 d 后菌體濃度極極顯著大于其他5 種供試氮源物質（P＜0.001）。在培養后期，以茶氨酸和谷氨酸為氮源的瓶中產生絮狀物質（醋酸纖維），分析原因，可能是茶氨酸和谷氨酸這兩種氨基酸為菌株Q4 提供生長所需的營養物質，這些營養物質刺激菌株Q4 分泌胞外多糖和蛋白質等物質產生絮狀物質。

圖10 氮源物質對菌株Q4 單獨培養OD600 的影響圖

2.4.2 氮源對菌株Q4 發酵液pH 值的影響

由圖11 可知，以亞硝酸鈉為氮源的發酵液pH 值維持在5.78～5.99，以其他5 種物質為氮源的菌株發酵液pH 值均呈緩慢下降趨勢，菌株以谷氨酸為氮源的發酵液初始pH 值最低。

圖11 氮源物質對菌株Q4 單獨培養pH 的影響圖

2.4.3 氮源對菌株Q4 發酵液總酸的影響

由圖12 可知，以茶氨酸、谷氨酸、氯化銨和硫酸銨為氮源培養時，菌株Q4 發酵液總酸含量隨時間變化而逐漸升高；培養10 d 后，以茶氨酸為氮源的發酵液總酸達到最大值5.30 g·L-1，極極顯著高于對照組發酵液的總酸含量（P＜0.001）。以亞硝酸鈉和硝酸鉀為氮源時，菌株發酵液的總酸含量變化較小，相對平穩。

圖12 氮源物質對菌株Q4 單獨培養總酸的影響圖

3 結論與討論

布魯塞爾酒香酵母和葡糖醋酸桿菌是茶菌自然發酵的優勢菌株[1,3]。與葡萄酒、果醋和生物乙醇發酵相比，布魯塞爾酒香酵母和葡糖醋酸桿菌菌株的營養需求和發酵性能在茶菌發酵系統中了解很少。

果糖、葡萄糖和蔗糖是菌株Q3 生長和產酸的良好碳源物質；硫酸銨、氯化銨是良好的氮源營養，而乳糖、硝酸鉀對菌株Q3 生長和產酸促進作用弱，亞硝酸鈉不利于菌株Q3 的生長和產酸。酒香酵母屬的菌株碳源譜廣，可利用豐富的碳水化合物，以葡萄糖作碳源較為適合[8]。在有氧和營養缺乏的條件下，酒香酵母可以利用乙醇和乙酸作為唯一碳源而生存；但在無氧條件下，酒香酵母又可以成為優良的乙醇生產菌株，可以耐受15%的乙醇含量和pH=3 的酸性環境[12]。酒香酵母可利用的氨基酸氮源廣泛，以谷氨酰胺較好[13]。在單獨培養條件下，菌株Q3 在茶糖水培養液中發酵產酸能力強于菌株Q4，尤其是谷氨酸對菌株Q3 產酸的促進作用，值得進一步關注。

相較于菌株Q3，菌株Q4 對供試碳源和氮源物質的選擇更為嚴格；葡萄糖和茶氨酸分別是促進菌株Q4生長的最佳碳源和氮源物質。KOLESOVS 等[14]發現對菌株K.rhaeticusMSCL 1463 產膜有利的碳源成分是葡萄糖，而乳糖和半乳糖不利于產膜。簡單碳源如甘露醇、甘油、葡萄糖和果糖有利于醋酸菌生長和產細菌纖維素膜[15]。在產纖維素醋酸菌的研究中，相對于碳源成分，對K.rhaeticus菌株氮源成分的研究明顯不夠。ASWINI 等[16]發現豐富氮源如酵母浸膏和牛肉浸膏對醋酸菌的產膜有利，而硝酸銨、硝酸鈣和硝酸鈉等硝態氮、胺態氮不利于纖維素的生產。

不同菌株的營養需求差異可能是茶菌發酵過程中菌株互作關系和菌群動態變化的基礎[2]。茶菌發酵過程中微生物對茶葉成分的生物轉化研究較多，茶葉成分的轉化是形成茶菌營養、風味和生理功能的基礎[1-2]。但是，營養成分如何影響發酵過程中微生物的生長、代謝和種群更迭，研究很缺乏。因此，分析碳、氮營養對菌株Q3 和Q4 生長和產酸特性的作用，可以為今后人工菌群的構建和發酵基質的開發打下基礎。