大豆油中蛋白質殘留量測定方法學研究

◎ 巫建新，唐順之，李 遙，白 柏，魏劭恒，楊玉瓊，李佳俐，許文東

（1.廣州白云山漢方現代藥業有限公司，廣東 廣州 510240；2.中藥制藥過程技術與新藥創制國家工程研究中心，廣東 廣州 510240；3.廣東省藥用脂質重點實驗室，廣東 廣州 510240）

大豆油是日常生活中常見的一種植物油，主要成分為脂肪，是人體重要的營養來源，可以為機體提供能量，維持機體體溫，支撐臟器，促進糖代謝和脂溶性維生素吸收等作用[1]。大豆油含有豐富的脂肪酸，其中亞油酸含量在48%～58%，亞油酸有助于降低血清膽固醇和抑制動脈血栓的形成[2]，具有極高的營養價值。

通過壓榨或者溶劑提取得到的大豆毛油含有較多的雜質，不能直接食用，必須經過脫膠、脫酸、脫色、脫臭等精煉工序處理，去除其中殘留的膠質、色素、氧化物、磷脂、蛋白質、游離脂肪酸、金屬元素等大部分雜質，才能有較好的外觀、氣味、滋味和貯藏穩定性。其中油脂和蛋白質混合受熱會產生更多的苯并芘[3]，而苯并芘是一種強致癌物[4]，我國食用植物油衛生標準規定食用植物油中苯并芘的限量不超過10 μg·kg-1。因此控制大豆油中蛋白質殘留量有利于減少大豆油煎炸過程中苯并芘的產生，提高食用大豆油的安全性。

蛋白質測定方法有定氮法、福林酚法、雙縮脲法、燃燒法、考馬斯亮藍法以及紫外-可見分光光度法等[5]。雙縮脲法靈敏度偏低，考馬斯亮藍法對于不同樣品的蛋白質測定結果可能存在一定偏差，紫外-可見分光光度法易受溶液中的雜質影響，標準曲線難以準確繪制。此外由于大豆油不溶于水，無法通過溶解后顯色測定蛋白質；而采用定氮法，可以對大豆油進行消解，去除大豆油基質的影響，測定氮含量，再換算為蛋白質含量，更適合測定大豆油中的蛋白質殘留量。本文旨在通過開發適用于大豆油中蛋白質殘留量的分析方法，測定大豆油中蛋白質殘留量，為評估大豆油中蛋白質殘留風險提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸（AR）、乙醇（AR）、硼酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑，以上試劑均購自廣州化學試劑廠；鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1），購自深圳市博林達科技有限公司；硫酸銨（≥99.99%），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Kjeltec? 8420 自動凱氏定氮儀，丹麥福斯有限公司；MS204S 電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司；消化爐，丹麥福斯有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

硼酸（H3HO3）溶液（10 mg·mL-1）：稱取10 g H3HO3，用水溶解并稀釋至1 000 mL；氫氧化鈉（NaOH）溶液（400 mg·mL-1）：稱取40 g NaOH 加水溶解后，放冷，并稀釋至100 mL；甲基紅乙醇溶液（1 mg·mL-1）：稱取0.1 g 甲基紅，用乙醇溶解并稀釋至100 mL，可用超聲水浴促進溶解；溴甲酚綠乙醇溶液（1 mg·mL-1）：稱取0.1 g 溴甲酚綠，用乙醇溶解并稀釋至100 mL；混合指示液：每10 L 硼酸溶液添加70 mL 甲基紅乙醇溶液與100 mL 溴甲酚綠乙醇溶液制成；硫酸銨[(NH4)2SO4]標準溶液：精密稱取105 ℃干燥2 h 的(NH4)2SO4約33 mg，置于100 mL 容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含(NH4)2SO4約0.33 mg 的硫酸銨標準溶液。

濃度梯度基準物質溶液：分別精密吸取硫酸銨標準溶液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL 于干燥的250 mL 凱氏消化管中，按照樣品制備方法操作制得系列濃度梯度基準物質溶液。

1.3.2 樣品制備

取供試品0.5 g，精密稱定，移入干燥的250 mL凱氏消化管中，加入2 片凱爾特催化片Cu 3.5 及12 mL硫酸，搖勻。待以上樣品完全浸濕后移至預熱好的FOSS 消化爐（420 ℃）中，套上排廢罩，開啟冷凝水（開始時需將水抽氣泵全開，5 min 后調小抽氣泵水流使酸霧恰好被吸入滌氣罩），開始消化，直至全部樣品變為透明的藍綠色澄清液體（大約90 min）后，消化完畢，將消化管連同消化管架和滌氣罩一起從消化爐中取出，冷卻10～20 min 后，加入50 mL 水，備用。同時制備樣品空白溶液。按照 Foss Kjeltec? 8420 自動分析定氮儀的要求，設定凱氏定氮分析程序進行測定。

1.3.3 試樣中蛋白質的計算

計算公式為

式中：X為試樣中蛋白質的含量，g/100 g；v為樣品溶液消耗鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1）的體積，mL；v0為試劑空白消耗鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1）的體積，mL；c為鹽酸滴定液濃度，mol·L-1；0.014 0 為鹽酸滴定液（0.02 mol·L-1）相當的氮的質量，g；m為供試品的質量，g；6.25 為供試品中氮換算為蛋白質的系數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

使用基準硫酸銨制備6 個濃度基準物質溶液并使用自動分析定氮儀測定，以氮含量為橫坐標，滴定體積為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程和相關系數。如表1 所示，氮含量在0.063 6～0.635 9 mg（即相當于樣品中蛋白質含量在0.080%～0.795%）時線性關系良好。

表1 線性和范圍表

2.2 取樣量考察

分別稱取同一大豆油供試品0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、5.0 g，按照供試品溶液的制備方法平行制備2 份。結果顯示，稱樣量為1.0 g、1.5 g、2.0 g、5.0 g 時，供試品未能完全消解，消解物呈黑色團塊狀，并膨脹至消解管上部，硫酸也因長時間消解而揮干。稱樣量為0.5 g 時，供試品可消解為藍綠色透明狀液體，因此方法采用的稱樣量為0.5 g。

2.3 檢出限和定量限

制備7 份樣品空白溶液并測定，通過空白試驗標準偏差計算方法檢出限（Method Detection Limit，MDL），計算公式如下

式中：n為樣品的平行測定次數；t為自由度為n-1，置信度為99%時的t分布值（單側），此處t=3.143；S為n次平行測定的標準偏差。

計算結果如表2 所示，該方法的檢出限為0.027%。

表2 檢出限結果表

分別稱取同一大豆油供試品9 份，每3 份各添加硫酸銨標準溶液0.05 mL、0.08 mL、0.10 mL，按照供試品溶液制備方法，制備理論氮加入量為0.035 mg、0.056 mg、0.070 mg 的加標供試品溶液并進行測定。結果如表3 所示，當氮加入量為0.070 mg 時，加標回收率在92.7%～98.3%，重復性（n=3）RSD ≤4%，符合定量限要求，此時對應的含量0.087%即為方法定量限。

表3 定量限結果表

2.4 精密度

分別稱取同一大豆油供試品6 份，添加硫酸銨標準溶液0.10 mL，按照供試品溶液制備方法，制備理論氮加入量為0.070 mg的加標供試品溶液并進行測定，計算6 份樣品氮含量的RSD 值作為重復性結果。另一人員同法操作，計算兩人員12 份樣品氮含量的RSD值作為中間精密度結果。同一人員連續3 d 同法操作，計算18份樣品氮含量的RSD值作為日間精密度結果。如表4 所示，重復性（n=6）、中間精密度（n=12）和日間精密度（n=18）的RSD ≤4%，說明本方法精密度良好。

表4 精密度結果表

2.5 準確度

分別稱取同一大豆油供試品6 份，添加硫酸銨標準溶液0.10 mL，按照供試品溶液制備方法，制備理論氮加入量為0.070 mg 的加標供試品溶液并進行測定，計算加標回收率。結果如表5 所示，加標回收率在92.1%～97.9%，重復性（n=6）RSD ≤4%，符合方法學要求，說明本方法準確度良好。

表5 準確度結果表

2.6 樣品測定

取多批白云山漢方公司自制的大豆油樣品按驗證后的蛋白質殘留量測定方法進行檢測，結果顯示大豆油中蛋白質殘留量均低于檢出限（0.027%），說明大豆油中蛋白質殘留風險較低。

3 結論

本文對氮測定法進行方法驗證，開發出適用于大豆油蛋白質殘留量測定方法，該方法最高取樣量是0.5 g，繼續增加取樣量會導致消化不完全，影響檢測進行。該方法檢出限和定量限分別為0.027%和0.087%。本方法在0.080%～0.795%線性關系良好，且精密度和準確度均符合方法學要求，能滿足大豆油蛋白質殘留量測定，可以為大豆油蛋白質殘留的安全性評估提供方法依據。