嗜熱鏈球菌抑制法測定鮮乳中抗生素殘留檢驗方法的優化

◎ 張 艷，王琳帆，張文博，陳奕杉，賀珊珊

（富平縣檢驗檢測中心，陜西 富平 711700）

抗生素不僅是人類治療疾病的常用藥物，還是治療動物疾病的常用藥物[1]。目前常用的抗生素主要有青霉素、鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素等。該類抗生素對大量的化膿性細菌，如葡萄球菌、鏈球菌等均有很好的抑制作用，從而可以治療奶牛的乳房炎等疾病。很多養殖戶為了治療或者預防奶牛乳房炎，存在抗生素用藥不當或濫用的情況。抗生素容易在動物體內及鮮乳中殘留，不僅影響鮮乳品質，還會危害人類健康[2]。《食品衛生微生物學檢驗 鮮乳中抗生素殘留檢驗》（GB/T 4789.27—2008）第一法嗜熱鏈球菌抑制法，就是基于抗生素對鏈球菌屬的抑制原理來測定鮮乳中的抗生素殘留[3]。通過調研當地乳品加工企業以及檢驗檢測機構，發現該檢驗方法準確度低，經常出現假陰性結果，目前多用試劑盒免疫分析法進行抗生素檢測。由于試劑盒法僅能作為企業內檢，無法出具正式檢驗報告，故需對該方法進行優化，提高靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

鮮羊乳，富平縣韋村奶山羊養殖戶。

嗜熱鏈球菌菌株（菌株標準編號：ATCC14485；批號：20210330），廣東省微生物菌種保藏中心；無抗生素脫脂牛乳粉（伊利脫脂奶粉，批號：20220310），New Zealand Nutritional Wellness Limited；2,3,5-氯化三苯四氮銼（TTC）（CAS NO：298-96-4；批號：211226），上海藍季生物；青霉素G 鉀標準品（CAS NO：113-98-4；批號：21070867），壇墨質檢標準物質中心；鏈霉素標準品（CAS NO：3810-74-0；批號：130308-201514），中國食品藥品檢定研究院；慶大霉素標準品（CAS NO：1405-41-0；批號：130326-201716），中國食品藥品檢定研究院；卡那霉素標準品（CAS NO：25389-94-0；批號：130319-201511），中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器設備

SPX-150B-Ⅱ恒溫培養箱，上海悅豐儀器儀表有限公司；HH-S8A 電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；天平、LS-100HG 立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫療設備有限公司；BSC-1300-Ⅱ A2 生物安全柜，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；MX-S可調式混勻儀，大龍興創實驗儀器北京股份有限公司；無菌刻度吸管（1 mL，具0.01 mL 刻度；10.0 mL，具0.1 mL 刻度）；移液槍（50～200 μL，200～1 000 μL）；無菌試管（18 mm×180 mm）。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢驗原理

樣品經80 ℃殺菌后，添加定量的嗜熱鏈球菌菌液，經過培養嗜熱鏈球菌開始增殖。這時加入代謝底物2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride，TTC），若樣品中不含有抗生素或者抗生素的濃度低于檢測限，嗜熱鏈球菌將繼續增殖，還原TTC 為紅色物質[4]。相反，如果樣品中含有高于檢測限的抗生素，則嗜熱鏈球菌增殖受到抑制，TTC 不會被還原，保持原色。

1.3.2 試劑準備

（1）滅菌脫脂乳。稱取9.00 g 無抗生素脫脂牛乳粉，加入50 ℃的蒸餾水90 mL，攪拌使其完全溶解，并分裝于試管中（9 mL/支），115 ℃滅菌20 min。

（2）4% 2,3,5-氯化三苯四氮銼水溶液。稱取1.00 g TTC 溶解于25 mL 蒸餾水中，115 ℃滅菌20 min。

（3）青霉素G 參照溶液。用無菌磷酸鹽緩沖液配制青霉素G 鉀標準溶液約300 IU·mL-1（即190 mg·L-1），用滅菌無抗脫脂乳稀釋至0.06 IU·mL-1（即38 μg·L-1），繼續用滅菌無抗脫脂乳稀釋至0.006 IU·mL-1（即3.8 μg·L-1），備用。

1.3.3 標準溶液配制

（1）青霉素標準溶液（0.3 mg·L-1）。精確稱取30 mg 青霉素G 鉀標準物質于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成300 mg·L-1的青霉素標準溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成為0.3 mg·L-1的青霉素標準溶液，備用。

（2）鏈霉素標準溶液（5.0 mg·L-1）。精確稱取50 mg 鏈霉素標準物質于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成500 mg·L-1的鏈霉素標準溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成為5.0 mg·L-1的鏈霉素標準溶液，備用。

（3）慶大霉素標準溶液（3.0 mg·L-1）。精確稱取30 mg 慶大霉素標準物質于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成300 mg·L-1的慶大霉素標準溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋至3.0 mg·L-1的慶大霉素標準溶液，備用。

（4）卡那霉素標準溶液（5.0 mg·L-1）。精確稱取50 mg 卡那霉素標準物質于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成500 mg·L-1的卡那霉素標準溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成為5.0 mg·L-1的卡那霉素標準溶液，備用。

1.3.4 測試菌液準備

（1）活化菌種。取一環嗜熱鏈球菌菌種，接種于9 mL 滅菌脫脂乳中，置于36 ℃生化培養箱中培養15 h 后，放于冰箱冷藏備用。

（2）測試菌液。將活化后的菌種接種于9 mL 滅菌脫脂乳中，于36 ℃生化培養箱中培養15 h 后，混勻，取1 mL 培養液加入9 mL 滅菌脫脂乳，混勻稀釋成測試菌液。

1.3.5 樣品準備

以鮮乳為樣品，分別加入國標中1 倍檢出限、10 倍檢出限、100 倍檢出限的青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素標準溶液，配制成表1中不同加標濃度、不同加標物質的12 種加標樣品。

表1 樣品加標濃度表

1.3.6 樣品處理及培養

分別取表1 中12 組加標樣品9 mL 于試管中，每份樣品另做一份平行樣，同時再做陰性對照（9 mL 滅菌脫脂乳）和陽性對照（9 mL 0.06 IU·mL-1青霉素G 參照溶液）各一份，所有試管置于80 ℃水浴加熱5 min，冷卻至37 ℃以下，加入測試菌液1.0 mL，輕輕混勻試管，36 ℃水浴2 h，加4% TTC 水溶液0.3 mL，渦旋混勻，36 ℃避光水浴培養30 min，觀察顏色變化。若顏色沒有變化，于36 ℃避光水浴中繼續培養30 min觀察最終顏色變化（當試管中樣品呈乳白色則為抗生素陽性結果，若試管樣品呈紅色則為抗生素陰性結果。陽性結表明樣品中含有高于檢出限的抗生素；陰性結果表示樣品中不含有抗生素或抗生素濃度低于檢出限），觀察要迅速，避免光照過久出現干擾[5]。

2 結果與分析

2.1 國標法檢測結果

按照國標法對加標樣品進行測定，結果見表2。

表2 國標法加標樣品檢測結果表

由表2 可知，陽性對照結果為陽性，陰性對照結果為陰性，表明該檢驗過程有效，不存在外在污染。加標樣品檢出陽性結果的最低加標濃度即為加標抗生素（青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素）的最低檢出限[6]。結合表1、表2 結果，常見抗生素的最低檢出限分別為青霉素30 μg·L-1、鏈霉素5 000 μg·L-1、慶大霉素3 000 μg·L-1、卡那霉素5 000 μg·L-1。實驗結果表明按照GB/T 4789.27—2008 檢驗常見抗生素的最低檢出限高于國標中最低檢出限，檢驗方法的靈敏度低。

2.2 方法優化

2.2.1 原因分析

常見抗生素的最低檢出限過高可能是嗜熱鏈球菌添加量過大，所添加的低濃度抗生素無法完全抑制嗜熱鏈球菌的增殖，從而顯示陰性。

2.2.2 解決方案

為了檢出低濃度的抗生素殘留，對檢驗方法進行優化。配制添加國標最低檢出限濃度的青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素標準溶液的加標樣品，作為樣品中抗生素殘留量，通過調節嗜熱鏈球菌添加量來驗證檢出濃度。

2.2.3 實驗方法

（1）測試菌液制備。將經活化的嗜熱鏈球菌菌株接種到9 mL 滅菌脫脂乳中，置于36 ℃生化培養箱中培養15 h，取1 mL 培養液加入9 mL 滅菌脫脂乳，混勻成為測試菌液，備用。

（2）樣品準備。①樣A：100 mL 容量瓶中加入1.0 mL 0.3 mg·L-1青霉素標準溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成青霉素殘留濃度為3.0 μg·L-1的加標樣品。②樣B：100 mL 容量瓶中加入1 mL 5.0 mg·L-1鏈霉素標準溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成鏈霉素殘留濃度為50 μg·L-1的加標樣品。③樣C：100 mL 容量瓶中加入1 mL 3.0 mg·L-1慶大霉素標準溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成慶大霉素殘留濃度為30 μg·L-1的加標樣品。④樣D：100 mL 容量瓶中加入1 mL 5 mg·L-1卡那霉素標準溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成卡那霉素殘留濃度為50 μg·L-1的加標樣品。

（3）樣品處理及培養。分別取2.2.3（2）樣品各9 mL于試管中，每份樣品取10 份，同時再做陰性對照（9 mL滅菌脫脂乳）和陽性對照（9 mL 0.006 IU·mL-1青霉素G 參照溶液）各5 份，所有試管置于80 ℃水浴加熱5 min，冷卻至37 ℃以下，分別加入50 μL、100 μL、300 μL、500 μL、1 mL 測試菌液，輕輕混勻試管，36 ℃水浴2 h，加4% TTC 水溶液0.3 mL，渦旋混勻，36 ℃避光水浴培養30 min，觀察顏色變化，如顏色沒有變化，于36 ℃避光水浴中繼續培養30 min 作最終觀察，觀察要迅速，避免光照過久出現干擾。

2.3 優化方法的結果與分析

方法優化后，按照國標添加量1 mL 的0.05 倍、0.1 倍、0.3 倍、0.5 倍和1.0 倍添加不同量測試菌液，檢驗結果見表3。

表3 添加不同量測試菌液檢驗結果表

由表3 可知，當加50 μL 測試菌液時，陰性對照檢測結果為陽性，實驗失敗。而當加100 μL 測試菌液時，加標樣品均能檢出陽性，陰性、陽性對照符合要求。當測試菌液加量后均檢出陰性結果。當添加菌量為100 μL 時，常見抗生素的最低檢出限分別為青霉素3.0 μg·L-1、鏈霉素50 μg·L-1、慶大霉素30 μg·L-1、卡那霉素50 μg·L-1。表明可以通過適當減少嗜熱鏈球菌的添加量來提高該檢驗方法的靈敏度。

3 結論

上述實驗結果表明，按照GB/T 4789.27—2008 檢驗方法的靈敏度低，可以通過適當減少嗜熱鏈球菌的添加量來提高該檢驗方法的靈敏度。