超聲波-微波預處理輔助酶解制備大豆降糖肽及其穩定性分析

◎ 滕 飛，李欣芯，孟繁達，張和珍，婁沐雨，許 晶

（東北農業大學 文理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

《國家基層糖尿病防治管理指南（2022）》指出，糖尿病是一種由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是胰島素分泌和（或）利用缺陷所造成[1]。按照發病機制以及胰島功能的不同，糖尿病主要分為I 型糖尿病、II 型糖尿病、妊娠糖尿病和非典型糖尿病4 類[2]。此外，國際糖尿病聯盟在發布的2022 年糖尿病地圖報告中也表明糖尿病是新型冠狀病毒感染不良結果的重要危險因素，且患有I 型或II 型糖尿病的人若血糖控制不佳則更有可能在感染新型冠狀病毒的情況下發生糖尿病酮癥酸中毒[3]。目前，市場上針對糖尿病的治療藥物主要有雙胍類（如二甲雙胍）、波糖類（如伏格列波糖）、列汀類（如阿格列汀）和胰島素等[4-5]。這些藥物長期服用不僅會提高醫治成本、增加經濟負擔，同時會產生一系列副作用，如低血糖、皮膚病變、胃腸道不適和腹型肥胖等。因此，需要探索出更加安全有效且成本低廉的防治方案。

蛋白質經過酶水解后產生的肽段可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑、α-淀粉酶抑制劑或二肽基肽酶Ⅳ抑制劑，對II 型糖尿病具有輔助治療作用[6]。目前，物理-酶解復合改性方法已成為高效、快速制備蛋白酶解物的研究熱點之一。物理-酶解復合改性多見于超聲波-酶解復合改性、微波-酶解復合改性、超高壓-酶解復合改性和高溫蒸汽-酶解復合改性等方法。超聲波-微波預處理技術聯合了超聲波和微波兩種物理改性手段，可在超聲波誘導蛋白質構象變化，暴露出更多蛋白質切割位點的同時，利用微波引起蛋白質結構的展開和活性位點暴露，進一步提高蛋白酶的水解效率[7-8]。但是，超聲波-微波預處理技術主要應用于生物活性有效成分的提取，在制備具有生物活性的肽段領域鮮有研究。

本文以大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）為原料，以α-葡萄糖苷酶抑制率為考察指標，研究酶解改性和超聲波-微波預處理輔助酶解復合改性方法制備具有降血糖活性的大豆降糖肽，確定超聲波-微波預處理輔助酶解制備大豆降糖肽的最優條件，分析大豆降糖肽的穩定性，為開發高活性和高穩定性的降血糖保健產品奠定理論基礎，為充分利用大豆蛋白資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，北京市瑞達恒輝有限公司；中性蛋白酶，北京博奧拓達科技有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（PNPG），Aladdin 公司；α-葡萄糖苷酶，Solarbio 有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

超聲微波化學反應器，鞏義市科瑞儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；DZKW 型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器廠；K750X 真空冷凍干燥器，英國Quorum 公司；Tecan sunrise 酶標儀，奧地利Tecan 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水解度的測定

采用pH-stat 法，水解度的計算公式為

式中：h代表單位質量蛋白質中被水解的肽鍵的量，mmol·g-1；htot代表單位質量蛋白質中肽鍵的總量，mmol·g-1，大豆蛋白為7.75 mmol·g-1。

水解過程中加入堿液的量與斷裂肽鍵數量的定量關系，計算公式為

式中：B代表酶解過程中消耗的堿液的體積，mL；N代表堿液的濃度，mol·L-1；α代表氨基酸的解離數；Mp代表參加水解的蛋白質的質量，g。

α所代表氨基酸的解離數，計算公式為

式中：pK值根據Gibbs-Helmholz 方程計算[9]，代表氨基酸解離常數。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參考LEE 等[10]的研究檢測α-葡萄糖苷酶抑制率，分別取200 μL 0.15 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶溶液和50 mmol·L-1對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（P-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside，PNPG）溶液，與100 μL 樣品溶液混合，用pH=6.8 的0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液定容至1 000 μL，在37 ℃下孵育60 min。孵育結束后立即添加1 500 μL 0.25 mol·L-1的Na2CO3溶液終止反應。將反應溶液搖勻后，取200 μL 液體于96 孔微板，使用Tecan sunrise 酶標儀在405 nm 處測量吸光度。通過檢測反應體系內剩余的α-葡萄糖苷酶與PNPG 反應所釋放的黃綠色產物對硝基苯酚（P-Nitrophenol，PNP）的含量，計算酶活性。α-葡萄糖苷酶抑制率的計算公式為

式中：A代表樣品組的吸光度；A0代表無樣品組的吸光度；A1代表無樣品和無PNPG 組的吸光度；A2代表無PNPG 組的吸光度。

1.2.3 酶水解制備大豆降糖肽的最優工藝

配制最佳濃度（3%）的SPI 溶液，在55 ℃下攪拌30 min，調節反應體系的pH 值為7，以最佳加酶量（7 000 U·g-1）向反應體系中加入中性蛋白酶，在反應過程中向反應體系滴加濃度為0.5 mol·L-1的NaOH溶液，保證反應體系始終維持在pH=7。反應達到最佳酶解時間（60 min）后，在100 ℃條件下水浴反應10 min滅酶活。待酶解液冷卻至室溫后，在10 000 r·min-1條件下離心10 min，冷凍干燥上清液，即得到酶水解制備的大豆降糖肽（Soybean Protease Hydrolysate，SPH），將凍干樣品密封于4 ℃下保存備用。

1.2.4 超聲波-微波預處理輔助酶水解制備大豆降糖肽工藝的優化

（1）最佳超聲波功率的確定。配制3%的SPI溶液，置于超聲波微波化學反應器中，設置微波功率500 W、超聲波-微波預處理溫度40 ℃、超聲波-微波預處理時間10 min，分別在100 W、200 W、300 W、400 W 和500 W 的超聲波功率下對SPI 溶液進行預處理。物理改性結束后，參照1.2.3 的方法進行大豆分離蛋白的酶解改性，記錄NaOH 消耗的體積，計算水解度。待酶解液冷卻至室溫后，在10 000 r·min-1條件下離心10 min，冷凍干燥上清液，得到超聲波-微波預處理輔助酶水解制備的大豆降糖肽（Ultrasonic Microwave Pretreatment Soybean Protease Hydrolysate，UM-SPH）。將凍干的樣品溶解成一定濃度的溶液，測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標篩選最佳超聲波功率。

（2）最佳微波功率的確定。配制3%的SPI 溶液，置于超聲微波化學反應器中，設置最佳超聲波功率200 W、超聲波-微波預處理溫度40 ℃、超聲波-微波預處理時間10 min，分別在100 W、200 W、300 W、400 W、500 W、600 W 和700 W 的微波功率下對SPI溶液進行預處理。物理改性結束后，參照1.2.4（1）的方法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標篩選最佳微波功率。

（3）最佳超聲波-微波預處理溫度的確定。配制3%的SPI 溶液，置于超聲微波化學反應器中，設置最佳超聲波功率（200 W）、最佳微波功率（400 W）、超聲波-微波預處理時間10 min，分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃下對SPI 溶液進行預處理。物理改性結束后，參照1.2.4（1）的方法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標篩選最佳預處理溫度。

（4）最佳超聲波-微波預處理時間的確定。配制3%的SPI 溶液，置于超聲微波化學反應器中，設置最佳超聲波功率（200 W）、最佳微波功率（400 W）、最佳超聲波-微波預處理溫度（45 ℃），分別對SPI溶液進行0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min 和30 min 的預處理。物理改性結束后，參照1.2.4（1）的方法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標篩選最佳預處理時間。

1.2.5 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的穩定性表征

（1）儲存穩定性。將SPI、SPH 和UM-SPH 分別配制成30 mg·mL-1的樣品溶液，調節pH 值至7.0。在4 ℃下儲存28 d，每隔7 d 測量一次樣品溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率。根據降血糖活性表征酶解改性和超聲波-微波預處理輔助酶解改性對大豆降糖肽儲存穩定性的影響。

（2）熱穩定性。將SPI、SPH 和UM-SPH 分別配制成30 mg·mL-1的樣品溶液，調節pH 值至7.0。分別在37 ℃、50 ℃、65 ℃、80 ℃和95 ℃下加熱15 min，測定樣品溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率。根據降血糖活性表征酶解改性和超聲波-微波預處理輔助酶解改性對大豆降糖肽熱穩定性的影響。

（3）凍融穩定性。將SPI、SPH 和UM-SPH 分別配制成30 mg·mL-1的樣品溶液，調節pH 值至7.0。在-20 ℃的冰箱中儲存24 h，取出后置于37 ℃的水浴中解凍1 h，測定樣品溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率。根據降血糖活性表征酶解改性和超聲波-微波預處理輔助酶解改性對大豆降糖肽凍融穩定性的影響。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 超聲波-微波預處理輔助酶水解制備大豆降糖肽工藝的優化

2.1.1 超聲波功率對大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖1 可知，隨著超聲波功率的增大，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度先逐漸上升；在超聲波功率大于200 W 后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷下降。當超聲功率達到200 W 時，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達到最大值，分別為（77.62±0.45）%和（19.00±0.19）%。這可能是因為超聲波預處理引起的瞬態空化作用導致大豆分離蛋白的解折疊，增加了蛋白與酶的接觸面積，得到了降血糖活性較高的大豆降糖肽[11]。但當超聲波功率超過200 W 后，功率過大產生的巨大剪切力會使蛋白質分子加劇碰撞，導致蛋白質分子聚集，原本暴露出的酶切位點重新被掩埋，阻礙了酶解反應的進行，造成抑制α-葡萄糖苷酶活性的肽含量降低。因此，超聲波功率過高顯著降低了大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度（P＜0.05）。

圖1 不同超聲波功率下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

2.1.2 微波功率對大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖2 可知，隨著微波功率的增大，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均逐漸上升；在微波功率大于400 W 后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷降低。當微波功率達到400 W 時，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達到最大值，分別為（78.35±0.50）%和（19.30±0.21）%。微波處理促使大豆分離蛋白中的極性分子在電磁場中發生振動，導致蛋白質的結構展開，暴露出更多的酶切位點，促進了蛋白發生水解反應[8]。當微波功率超過400 W 后，在較高的功率下，大豆分離蛋白溶液體系的溫度迅速上升，導致蛋白質變性并且形成聚集體，阻礙酶解反應發生。因此，微波功率過高使大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度顯著降低（P＜0.05）。

圖2 不同微波功率下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

2.1.3 預處理溫度對大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖3 可知，隨著超聲波-微波預處理溫度的升高，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均逐漸上升；在超聲波-微波預處理溫度大于45 ℃后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷下降。當超聲波-微波預處理溫度達到45 ℃時，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達到最大值，分別為（79.64±0.41）% 和（19.87±0.19）%。這是因為在一定范圍內，溫度的升高有利于大豆分離蛋白的溶解能力和溶解速度的提高，導致蛋白質在溶液內分布更加均勻，從而促進其與蛋白酶的結合效率，提高了抑制α-葡萄糖苷酶活性的肽含量[12]。于麗娜等[13]通過微波預處理輔助酶解的改性技術制備花生蛋白肽，也得出了微波預處理溫度的升高促使花生蛋白肽的α-葡萄糖苷酶抑制率先升高后降低的實驗結果。

圖3 不同預處理溫度下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

2.1.4 預處理時間對大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖4 可知，隨著超聲波-微波預處理時間的增加，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均逐漸上升；當超聲波-微波預處理時間超過20 min 后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷降低。當超聲波-微波預處理時間為20 min 時，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達到最大值，分別為（81.46±0.31）% 和（21.25±0.43）%。超聲波-微波預處理20 min 之前，大豆分離蛋白溶液處于微波電磁場中，超聲波的空化作用破壞蛋白質的分子間作用力使其解折疊；隨著時間的延長，蛋白的分子熱運動不斷加劇，到預處理時間20 min 時，大豆分離蛋白在體系中的溶解性最佳，且酶切位點暴露最完全，酶解反應效率最高，抑制α-葡萄糖苷酶活性的肽含量最高[14]。超聲波-微波預處理20 min 之后，由于處理時間過長，超聲波和微波的不斷作用導致分子熱運動過于劇烈，會促進解折疊的蛋白質重組聚集，造成蛋白質表面的酶切位點被掩埋，影響酶與蛋白質的結合[15]。江明珠[16]對大豆分離蛋白進行超聲波預處理，在研究超聲波預處理時間對大豆蛋白肽的影響時，也得出了α-葡萄糖苷酶抑制率先升高后降低的結論。

圖4 不同預處理時間下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

綜合上述實驗結果，確定超聲波-微波預處理輔助酶水解制備大豆降糖肽的最優工藝為超聲波功率200 W，微波功率400 W，超聲波-微波預處理溫度45 ℃，超聲波-微波預處理時間20 min，加酶量7 000 U·g-1，底物濃度3%，酶解時間60 min。

2.2 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的穩定性

2.2.1 儲存穩定性分析

儲存穩定性是衡量蛋白質產品包裝工藝、保質期和應用價值的重要指標。由圖5 可知，隨著儲存天數的增加，SPI的α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸降低；在28 d時，降糖活性僅為（15.61±0.72）%。在7 d 之內，SPH 和UM-SPH 的降糖活性無顯著變化（P＞0.05）；在14 d到21 d，SPH 和UM-SPH 的降糖活性幾乎保持不變；到第28 d 時，UM-SPH 仍能保持（76.14±0.73）%的α-葡萄糖苷酶抑制率，表現出良好的儲存穩定性。

圖5 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的儲存穩定性圖

2.2.2 熱穩定性分析

溫度對SPI、SPH 和UM-SPH 的降糖活性和抗氧化活性的影響如圖6 所示。當溫度為37～95 ℃時，SPI、SPH 和UM-SPH 的α-葡萄糖苷酶抑制率變化較小；與SPI 和SPH 相比，UM-SPH 始終保持最強的降血糖活性，表現出最佳的熱穩定性。綜上所述，超聲波-微波輔助酶解改性改善了大豆分離蛋白的熱穩定性，SPH 和UM-SPH 表現出了良好的熱穩定性，可實現37～95 ℃的熱加工，為投入工業生產提供了理論基礎[17]。

圖6 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的熱穩定圖

2.2.3 凍融穩定性分析

目前，冷凍是一種常見的延長食品貨架期的處理方法，不僅能保持食品的風味和營養價值，還能最大限度地減少微生物繁殖對食品的影響[18]。因此，考察大豆分離蛋白和大豆降糖肽的凍融穩定性具有一定的實際意義。由圖7 可知，凍融使SPI、SPH 和UM-SPH的α-葡萄糖苷酶抑制率均顯著降低（P＜0.05）。經歷3 次凍融處理，UM-SPH 的α-葡萄糖苷酶抑制率無顯著變化（P＞0.05）；第4 次凍融后，UM-SPH的降糖活性顯著降低（P＜0.05），但仍能達到（77.66±0.80）%的α-葡萄糖苷酶抑制率。與SPI 和SPH 相比，UM-SPH 降糖活性的凍融穩定性最佳。

圖7 豆分離蛋白及大豆降糖肽的凍融穩定性圖

3 結論

在酶解改性的基礎上，采用超聲波-微波輔助酶水解制備大豆降糖肽，獲得的最佳工藝條件為超聲波功率200 W、微波功率400 W、超聲波-微波預處理溫度45 ℃、超聲波-微波預處理時間20 min、加酶量7 000 U·g-1、底物濃度3%、酶解時間60 min，在此條件下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率為（81.46±0.31）%。本實驗制備的大豆降糖肽（SPH和UM-SPH），隨著儲存天數的增加和溫度升高，表現出良好的儲存穩定性和熱穩定性；與SPI和SPH相比，UM-SPH 的降血糖活性受凍融次數的影響最小，表現出最佳的凍融穩定性。酶解改性和超聲波-微波預處理輔助酶解改性提高了大豆分離蛋白的環境穩定性，3 種物質的穩定性順序為UM-SPH ＞SPH ＞SPI。