腐乳研究現狀及可控化調控技術展望

◎ 羅 靜，唐仁勇，易樹敏

（1.四川商務職業學院，四川 成都 611131；2.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106）

近年來，人們對植物源蛋白質的關注度越來越高，長期食用富含植物蛋白的食物可降低心血管疾病的發病率，提高新陳代謝率，增強人體骨骼的強度[1]。大豆具有較高的營養價值，其蛋白質含量為36.49 g/100 g，碳水化合物含量為30.16 g/100 g，多不飽和脂肪酸含量為11.255 g/100 g，鈣含量為277 mg/100 g，此外還含有豐富的鉀、鎂、大豆異黃酮及B 族維生素等營養物質，適用于開發各類大豆產品，包括肉制品和奶制品的替代物[2]。

腐乳是一種深受消費者喜愛，富含多種營養成分的傳統大豆發酵食品，其主要以大豆為原材料，以水、白酒、食鹽和香辛料為輔料，經過毛霉、根霉、細菌等微生物發酵而成，是我國四大傳統發酵調味品之一，也是餐桌上一道常見的佐餐食品[3]。目前，我國腐乳已經出口至東南亞、日本、美國等多個地區，受到世界人民的推崇和喜愛。100 g 腐乳中必需氨基酸含量可供成年人一日需要量[4]。腐乳中還含有黃酮、多肽、γ-氨基丁酸等活性成分和多種礦物元素，具有抗氧化、降低人體膽固醇含量、增強人體免疫力及預防細胞癌變與老年癡呆癥的作用[5]。

本文對腐乳的歷史、分類、制作工藝、功能菌種篩選、微生物菌群與風味品質的關系以及食用安全性等進行了綜述，并結合腐乳安全隱患因素的控制方法對未來可控化調控技術進行展望，目的是促使腐乳生產工藝流程可控化和標準化，為進一步提升腐乳品質、提升腐乳產業的安全化生產和推動腐乳產業綠色健康發展提供基礎支撐。

1 腐乳的歷史、分類和制作工藝

腐乳歷史悠久，風味獨特，滋味鮮美，有“東方奶酪”之稱[6]。腐乳起源于我國，一千多年前就有關于腐乳的記載，“干豆腐加鹽成熟后為乳腐”，從魏朝開始，腐乳就成為餐桌上的開胃菜，明清時期腐乳迅速發展，生產規模和技術不斷提升，李日華的《蓬櫳夜話》和王士楨的《食憲鴻秘》中均有腐乳制作方法的記錄。近代腐乳研究始于1920 年，1928 年開始對毛霉菌進行研究，其后，不斷有學者對腐乳品質、發酵菌種、制作方法進行探索[7]，并針對腐乳生產過程中各階段的變化情況進行了深入細致的研究，逐漸形成成熟的理論體系。

傳統腐乳制作工藝一般包括4 個步驟[8]。①制作豆腐。將煮沸的豆漿通過鹽沉淀制作成豆腐。②毛霉生長。將豆腐切小塊放置在毛霉適宜生長的環境中自然接種，使豆腐塊表面長滿毛霉。③加輔料腌制。加鹽抑制毛霉生長，加香辛料提升腐乳的風味口感。④密封成熟。將腌制好的豆腐塊放進玻璃瓶中，密封保存2～3 個月，即可食用。

根據腐乳的風味與色澤，可分為紅腐乳、青腐乳、白腐乳，紅腐乳又名紅方，是在發酵后期加入紅曲制作而成，成品表面呈紅色；白腐乳又名白方，發酵期間不加任何著色劑；青腐乳又名青方，是在發酵后期，以低濃度鹽水為湯料制作而成，成品表面呈青色，有特殊刺激性氣味。根據制作過程是否有微生物參與，可將腐乳分為腌制型和發酵型，腌制型腐乳是豆腐塊不經過前期微生物發酵長霉直接腌制而成；發酵型腐乳的豆腐塊先經過前期發酵長出毛霉，再進入后期腌制階段。發酵型腐乳按接種類型可分為天然接種與純菌種接種，天然接種是利用環境微生物自然發酵，純菌種接種使用的菌種主要有細菌、根霉、毛霉。

2 腐乳發酵的功能菌種

微生物在腐乳發酵過程中扮演著十分重要的角色，與腐乳風味、色澤、口感的形成密切相關，國內學者通過研究腐乳發酵功能菌種，為發酵腐乳的風味品質和安全性提供理論支撐[9]。目前常用的腐乳發酵菌種有毛霉、根霉、細菌。

2.1 毛霉

毛霉是我國腐乳生產時使用最多的菌種，四川、北京等地大多都使用毛霉發酵腐乳，占腐乳生產用菌總量的90%～95%[9]，腐乳生產常用菌種具體見表1。現代腐乳制作過程是在無菌環境下將毛霉菌種接種到豆腐塊表面，培養3～5 d 后，豆腐塊表面長滿白色或淡黃色菌絲，形成皮膜，毛霉對腐乳特殊口感和香味的形成有重要貢獻[9]。毛霉能分泌多種酶類，其中蛋白酶是決定腐乳品質的重要因素，可以分解豆腐中的蛋白質，生成肽類、氨基酸、有機酸和酯類等，使發酵腐乳富含多種營養成分[10]。LIU 等[11]研究發現腐乳內外部均存在多種蛋白酶，且蛋白酶活性與琥珀酸酯、組胺、三甲胺等成分顯著相關，表明蛋白酶對腐乳的成熟有重要促進作用。

表1 腐乳生產常用菌種表

2.2 根霉

根霉菌是發酵腐乳的另一種常用菌種，可分泌高活性的淀粉酶，從而使腐乳產生乳酸、延胡索酸等有機酸，也可產生酯類物質，提高腐乳的芳香氣味[12]。腐乳生產常用根霉菌如表1 所示。

根霉型腐乳是利用根霉菌發酵制成，根霉菌耐高溫，常在夏季高溫生產腐乳時使用。由于根霉菌產蛋白酶能力較低，發酵而成的腐乳外觀形狀與口感均不如毛霉型腐乳。因此，將毛霉菌與根霉菌混合制成復合菌種用于發酵腐乳，可改善腐乳品質，豐富營養價值，縮短生產周期并改善風味成分。

2.3 細菌

除根霉和毛霉外，還可利用細菌發酵腐乳。目前國內使用細菌發酵腐乳的廠家較少，可用于發酵腐乳的細菌主要有藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌，黑龍江克東腐乳是利用藤黃微球菌發酵制成的腐乳，其氨基酸含量高，味道鮮美，具有明顯的地域特色[9]。

3 腐乳風味成分研究

作為傳統發酵食品的一種，腐乳在中國乃至亞洲地區受到大眾歡迎，風味是評價腐乳產品質量的重要指標之一。近年來有關腐乳風味物質組成的研究越來越多，鑒定腐乳中揮發性風味成分的方法主要有氣相色譜-質譜聯用（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、氣相色譜-嗅覺-質譜聯用等方法結合液液萃取、頂空吸附、蒸餾萃取和固相微萃取。

MOY 等[13]采用GC-MS 對豆腐和腐乳中揮發性風味物質進行鑒定，豆腐發酵成腐乳的過程中，正己醛含量從2 828 μg·kg-1降至319.6 μg·kg-1，表明通過發酵可去除豆腐中不愉快氣味，發酵過程也是形成腐乳中以果香味與甜味為主的特有風味物質醇類和酯類的主要途徑。自制腐乳發酵過程中，異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯及壬醛等對風味形成影響較大，賦予腐乳果香味和奶香味。而樊艷[14]研究發現，茴香腦是自制腐乳中最主要的風味成分，乙醇是市購腐乳的最主要風味成分，風味成分不同可能是由生產腐乳所用原材料、生產環境、加工工藝不同引起的。風味組學研究對表征和鑒定腐乳中揮發性成分有重要作用，不同發酵階段腐乳香氣成分之間存在明顯差異，特征風味物質解析對改善腐乳品質有實際意義，可為完善腐乳產品質量體系提供科學指導，同時為進一步研究特征風味物質的形成機理、生產具有優良風味的腐乳奠定基礎[15]。本文對腐乳中的主要風味物質進行了總結，結果見表2。

表2 腐乳中主要揮發性風味成分表

盡管前人對腐乳中風味物質組成進行了詳細報道，但對腐乳中風味成分進行精準定量的研究較少，可以采用高分辨氣相色譜-嗅聞技術結合同位素稀釋分析與風味重構等方法對腐乳中的風味物質進行準確定量，并作為腐乳產品質量評價的依據，為完善腐乳揮發性風味物質研究機理提供理論支撐。

4 腐乳菌群與風味關系研究

微生物在腐乳發酵過程中分泌酶，促使蛋白質和脂類水解形成小分子物質，對腐乳風味有重大貢獻，腐乳中微生物群落結構與風味物質組成有較強的相關性。乳酸桿菌屬是市售腐乳中的優勢菌群，可促進風味物質的形成，是酯類和酸類風味的主要貢獻者，同時對抑制致病菌生長及延長貨架期有一定作用。而芽孢桿菌與魏斯氏菌可抑制風味化合物的產生，在腐乳制作過程中加入香辛料，腌制成熟后芽孢桿菌數量減少，說明香辛料能抑制其生長，促進腐乳風味形成與產品熟化[25]。然而，XIE 等[26]的研究表明，乳酸桿菌在腐乳中大量存在，但并未發現其與風味成分之間的相關性。發酵菌種與風味成分相關性的差異可能與腐乳生產方式有關，不同地理位置與氣候條件會使環境微生物發生改變，導致腐乳菌群與風味物質發生變化。

除乳酸菌外，腸桿菌科與不動桿菌屬對腐乳的最終品質有重要影響[27]。腸桿菌屬與腐乳中糖類、含氮化合物、大多數氨基酸的含量有關，氨基酸是改善腐乳風味的重要成分，而假單胞菌與腐乳中生物胺的合成相關，尤其是組胺與尸胺的合成，同時對酯類香氣成分的生成有一定的抑制作用[27]。青腐乳發酵前期，乳桿菌屬與四鏈球菌屬是優勢菌，與具有水果香、花香、酒香味的酯類、酮類、醇類物質緊密相關。隨著發酵的進行，明串珠菌屬與鹽厭氧菌屬的相對含量逐漸升高，與具有特殊臭味的含硫化合物及吲哚的含量呈現正相關關系，是青腐乳獨特風味的主要來源[17]。鏈球菌則與腐乳中的糖類和氨基酸的含量顯著相關[27]。研究發酵腐乳菌群組成與風味成分之間的相關性，對深入了解腐乳的發酵機理、選擇功能發酵菌株、生產工藝標準化和流程可控化具有推動作用。

目前，腐乳中微生物菌群的鑒定方法主要為擴增子測序，只能鑒定到屬水平。為深入研究微生物與風味之間的動態變化關系，可采用宏基因組測序將腐乳中微生物菌群鑒定到菌株水平，可結合風味物質鑒定研究腐乳中微生物菌群與揮發性風味成分的相關性[28]。

5 腐乳制作過程中潛在安全性問題

我國腐乳大多通過傳統發酵方式制作而成，生產環境開放，人工操作環節較多，導致生產批次間不穩定，存在安全隱患。腐乳發酵過程中，由于微生物氨基酸脫羧酶作用或醛類與酮類的胺化作用，可生成生物胺，食品中常見生物胺有腐胺、尸胺、組胺及酪胺等，過量攝入生物胺會使人體產生惡心嘔吐等不適癥狀[29]。GUAN 等[29]對38 份市售腐乳的生物胺含量進行了研究，檢出種類最多是腐胺和尸胺，檢出量最高是腐胺和酪胺，5 份白腐乳樣品中組胺含量超過50 mg·kg-1，生物胺總量從高到低為青腐乳＞白腐乳＞紅腐乳，與QIU 等[30]的研究結果一致。在腐乳加輔料腌制時加入10%～20%乙醇，可以顯著降低成品中生物胺的總量，且加入乙醇后多肽和氨基氮的含量有所增加。利用不同毛霉發酵腐乳，發現利用總狀毛霉發酵的腐乳中尸胺、亞精胺、精胺、組胺和酪胺的含量明顯低于雅致放射毛霉與五通橋毛霉。

腐乳蛋白質含量高，是蠟樣芽孢桿菌生長的良好載體，蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，無法保證腐乳安全性。周婷婷等[31]對市售腐乳進行抽檢，蠟樣芽孢桿菌檢出率為84.2%，蠟樣芽孢桿菌含量為102～105CFU·g-1，21%的樣品中蠟樣芽孢桿菌含量達到106CFU·g-1，《蠟樣芽胞桿菌食物診斷標準及處理原則》（W/S 82—1996）中食物中毒標準為105CFU·g-1。我國腐乳產業規模龐大，腐乳安全問題直接影響腐乳出口，為抑制蠟樣芽孢桿菌滋生，JIN 等[32]通過添加大蒜精油使蠟樣芽孢桿菌細胞變性死亡，有效控制其數量。腐乳行業應嚴格控制生產衛生條件，加強現場衛生管理，重視生產過程中有害菌的污染，同時使用合適發酵菌種和添加劑精準調控腐乳的食用安全性，保證腐乳生產的規模化與標準化。

6 可控化調控技術展望

國內外研究表明，功能菌株對于發酵食品風味品質起著關鍵作用。隨著現代生物技術與檢測手段的進一步發展，研究人員對腐乳發酵及成熟過程中菌群結構與風味品質的變化進行了深入解析，使人們對腐乳有了更深入的了解。為使腐乳生產菌株標準化和生產過程可控化，可采用宏基因組測序將腐乳中微生物菌群鑒定到菌株水平，并通過菌種強化技術改善腐乳菌群結構、提升腐乳風味[33]。可利用現代生物技術手段研究腐乳中微生物的代謝路徑，從而了解其互作機制，為腐乳產業標準化與可控化提供理論基礎，促進腐乳行業健康發展。

我國主要采取傳統方式制作腐乳，模式化和可控化程度較低。可在傳統生產的基礎上引入高新技術提升腐乳生產水平，對提高腐乳質量具有重要意義。通過傳感器獲取腐乳發酵過程信息，并將信息轉換成電信號或其他形式輸出，是實現在線監測和智能控制的首要步驟。同時利用智能監測設備實時監測發酵過程中溫度等指標的變化，可掌握發酵期間規律，根據發酵參數的變化，及時改進工藝參數，實現最優發酵[34]。高新技術的應用使腐乳發酵過程可控化成為可能，同時使腐乳生產向科學化和信息化邁進，對腐乳的品質提高具有指導意義。