釀酒酵母發酵降解銀杏葉多糖組分分析及活性研究

賀 瑩， 劉苗苗， 龐曉婷， 張如意

（呂梁學院生命科學系，山西呂梁 033000）

銀杏樹一般是人工栽培的， 栽培地遍布全國各地。 銀杏葉可以入藥，能促進血液循環，消除充血，緩解經絡痛、哮喘，清除混濁，減少脂質，減緩胸痛和心痛（李春艷，2011）。銀杏葉的脂溶性提取物在食品和醫藥行業已經有了較廣泛的應用，但開發和應用水溶性提取物的研究還很少（Liu，2021）。本研究以新鮮銀杏葉打汁接種釀酒酵母菌后置于搖床發酵降解， 為銀杏葉多糖的開發利用提供基礎。

目前， 對于銀杏葉多糖的活性研究主要集中在抗腫瘤和免疫調節方面（Fang，2020），如侯華新等（2005）研究了銀杏葉多糖的輔助抗腫瘤作用。各實驗室對銀杏葉多糖的類型和銀杏葉多糖的單糖組成的研究結果差異很大； 有些試驗研究對銀杏葉多糖進行了預分析， 但沒有分析出多糖的完整初級結構，也沒有進行結構和構象研究。利用微生物發酵降解后再提取的方法較少， 劉艷芳（2020）采用釀酒酵母發酵的方法對靈芝胞外多糖進行了降解，并對其產物在表觀黏度、分子質量、多糖得率和含量及單糖組成和生物活性等方面進行了系統比較和分析。 李萬叢（2019）以新鮮人參為原料， 經釀酒酵母CCTCC M 2016373 發酵后，采用水提醇沉法及Sevage 法脫蛋白獲得發酵后的人參粗多糖，包括未發酵多糖、發酵多糖和菌多糖3 種組分， 采用化學方法測定粗多糖各組分的中性糖、糖醛酸、蛋白質含量，對粗多糖的總抗氧化能力、 羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力進行了比較。

本研究通過釀酒酵母發酵銀杏葉多糖，其由水提醇沉法制備，用高效液相色譜法測定發酵不同時期銀杏葉多糖的單糖組成，對多糖中的單糖種類進行鑒定，并計算其摩爾百分比。 通過測定抑菌圈大小來研究釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖的抑菌性。 采用鄰苯三酚法和Fenton 法進行釀酒酵母發酵降解后銀杏葉多糖的抗氧化性的試驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 新鮮銀杏葉， 大明湖邊銀杏樹上采摘；馬鈴薯，星瑪客超市購買；釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌由呂梁學院微生物實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑 酵母膏、蛋白胨、苯酚，分析純，天津市光復精細化工研究所；牛肉膏，分析純，北京奧博星生物技術有限公司；無水乙醇，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司； 無水葡萄糖、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、標準單糖，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備 電子天平（FA2004），上海力辰儀器科技有限公司； 數顯電子恒溫水浴鍋（HH-6），常州國華電器有限公司；破碎機（DFT-100），溫嶺市林大機械有限公司； 醫用離心機（L350），湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司； 生化培養箱（SPX-25），上海躍進醫療器械有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS），上海申安醫療器械廠；數控超聲波清洗器（SB-100D），昆山市超聲儀器有限公司； 紫外可見分光光度計 （UV-3100PC），上海美譜達儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱（GZX-9146MBE），上海博訊實業有限公司醫療設備廠；恒溫培養振蕩器（ZWY-100D），上海智城分析儀器制造有限公司； 高效液相色譜儀（E2695），美國Waters 公司。

1.3 釀酒酵母的培養

1.3.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA） 的配制取200 g 馬鈴薯，1 L 去離子水，先進行水煮，煮爛后用8 層的紗布過濾。 去離子水繼續補充到1 L，放入稱好的20 g 葡萄糖和18 g 瓊脂粉， 一邊加熱一邊用玻璃棒慢慢攪拌一直到完全溶解。 把溶解后的液體倒進1 L 大燒杯中， 用去離子水加到1 L 刻度線，分裝入錐形瓶中密封，在121 ℃條件下高壓滅菌30 min，稍冷卻后倒入滅完菌的培養皿中，固體培養基凝固待用。

1.3.2 釀酒酵母發酵液體培養基的配制 稱取20 g 葡萄糖，添加5 g 酵母膏，再稱取10 g 蛋白胨，在自然pH 下加熱溶解后冷卻，分裝到容量為250 mL 的三角瓶，每個裝100 mL 即可，在121 ℃條件下高壓滅菌30 min，然后取出備用。

1.3.3 釀酒酵母菌培養 在已經滅菌的PDA 培養基上接種已培養好的釀酒酵母菌， 在30 ℃、90 r/min 的搖床培養48 h 充分活化， 等到菌長滿平板后， 切下適量的菌塊接入釀酒酵母發酵液體培養基， 繼續搖床培養48 h 后的菌液為一級種子液，之后繼續傳代，接種量為3%，再按照上述條件搖床培養48 h，菌種充分活化后的菌液即為二級種子液，4 ℃條件下冷藏待用。

1.4 發酵銀杏葉制備 新鮮銀杏葉與水配比為1：4 打汁，裝進三角瓶塞好棉塞滅菌，將已經活化好的釀酒酵母菌株接入新鮮銀杏葉汁中， 在搖床上培養72 h，分別于0、24、48、72 h 取樣進行分析檢測。

1.5 水提醇沉法提取發酵銀杏葉粗多糖 稱取釀酒酵母發酵不同時期的銀杏葉汁， 按照比例與去離子水充分攪拌，在溫度設置為85 ℃的水浴鍋中浸提銀杏葉汁8 h，在浸出過程中會出現蒸發，需要不斷加入去離子水并及時用玻璃棒攪拌。8 h后把浸提后的銀杏葉汁放到冰箱里過夜， 銀杏葉汁會產生沉淀， 把紗布折成6 層過濾沉淀后的上清液，然后離心上清液，再繼續放到水浴鍋中85 ℃的條件下濃縮，再倒進無水乙醇放到冰箱里過夜，離心取沉淀，然后烘干水分，干燥過程中要不斷去觀察，干燥完的褐色固體物就是粗多糖（劉奕辰，2019；Chen，2016）。

1.6 對釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖進行脫蛋白脫色處理

1.6.1 Sevage 法脫蛋白 配制所需濃度的釀酒酵母發酵后的銀杏葉多糖液， 正丁醇及氯仿混合在一起（正丁醇：氯仿=1：4），然后與發酵后的銀杏葉多糖溶液混合后超聲波清洗機振蕩20 min。 振蕩后再去離心， 直到白色物質不再出現在液面交界處（王路瑤，2019）。

1.6.2 活性炭吸附脫色 對釀酒酵母發酵后的銀杏葉多糖溶液進行脫色時用活性炭進行吸附，吸附后的溶液中加入4 倍的無水乙醇使其產生沉淀。 先離心再用無水乙醇把離心后的沉淀洗脫4次，多糖在冷凍干燥后取得。

1.6.3 苯酚-硫酸法測定多糖含量 稱取10 mg標準葡萄糖，用蒸餾水將其全部溶解并倒入容量瓶中， 然后向容量瓶中加入蒸餾水以定容至100 mL，葡萄糖標準液完成備用（何鋼，2015）。準備7 只洗干凈的試管，按順序向試管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 和1.2 mL 的標準液，然后再按順序補蒸餾水， 再依次倒進1 mL 苯酚和5 mL 濃硫酸，添加好后先放置20 min 進行反應。之后設置波長為490 nm 測各試管中樣品的吸光度， 記錄數據借助軟件畫出標準曲線。

再稱10 mg 釀酒酵母發酵后的銀杏葉多糖，定容后取2 mL， 再按照同樣的步驟測吸光度，記錄數據以后根據方程算出釀酒酵母發酵降解后多糖所占的比例。

1.6.4 釀酒酵母發酵降解銀杏葉多糖的組分分析取2 mg 釀酒酵母發酵后的銀杏葉多糖樣品，先三氟乙酸水解樣品， 然后用高效液相色譜法測定來自釀酒酵母發酵銀杏葉多糖的單糖成分。把D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-巖藻糖、D-鼠李糖、L-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖這些單糖作為混標，對釀酒酵母發酵降解銀杏葉多糖中的單糖種類進行鑒定，并且算出每種單糖所占的摩爾百分比，最后對釀酒酵母發酵降解不同時期的銀杏葉多糖的單糖組成進行比較分析。

1.7 釀酒酵母發酵降解銀杏葉多糖抑菌性研究

1.7.1 配制肉湯培養基 按比例配制牛肉膏、葡萄糖、 蛋白胨和瓊脂溶解滅菌后分別做成液體培養基和固體培養基。

1.7.2 活化菌種 選擇適量的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接進培養基中。在恒溫振蕩器120 r/min 的轉速中于37 °C 培養20 h，以確保細菌在液體培養基中的均勻分布并充分活化以形成種子溶液。

1.7.3 濾紙片抑菌圈試驗 把濾紙做成10 mm的小圓形，分別放到清洗過的培養皿中，把裝有小圓形濾紙片的培養皿與其他需要的儀器一起放進高壓蒸汽鍋中滅菌20 min。滅菌后把0.2 mL 的指示菌接到固體培養基， 借助涂布棒涂到培養基上盡量均勻，再把小圓形的濾紙片放到上面，最后將釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖的小液滴放到小圓形濾紙片上，等待24 h 后，測量抑菌圈的直徑， 將釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖對指示菌的抑制作用進行對比分析（王筱瑜，2019）。

1.8 釀酒酵母發酵降解銀杏葉多糖抗氧化活性的測定

1.8.1 鄰苯三酚法測定銀杏葉多糖抗氧自由基活性 吸取1.45 mL 濃度為0.1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷溶液，先提前加熱，到25 ℃時加入濃度為6 mmol/L 的鄰苯三酚50 μL， 混勻后加入釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖液。 向空白的樣品中加蒸餾水0.5 mL， 在波長320 nm 處每半分鐘測吸光度。 結果用抑制率表示（孟兆麗，2008）。

1.8.2 Fenton 法測定銀杏葉多糖抗羥自由基活性的測定 在Fenton 體系中加進1.5 mL 的磷酸緩沖液，0.2 mL 的藩紅，0.7 mL 濃度為2 mmol/L 的乙二胺四乙酸溶液，0.8 mL 發酵后的多糖液， 再加入0.8 mL1%的H202， 把幾種溶液攪拌均勻后在37 ℃的水浴鍋中進行保持溫度，30 min 后在520 nm的波長處測吸光度。 在對照組和空白組中加入相同體積的蒸餾水（王萌皓，2019）。結果按以下公式計算：

羥自由基清除率/%=A0-（Ax-Ax0）/A0×100；

式中：A0為空白對照的吸光值；Ax為加樣品的吸光值；Ax0為不加顯色劑H2O2。

最后對釀酒酵母發酵降解不同時期的銀杏葉多糖的抗氧自由基活性及抗羥自由基活性進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母發酵降解不同時期銀杏葉多糖含量 將釀酒酵母接種到新鮮的銀杏葉汁后， 提取發酵不同時期銀杏葉中的粗多糖， 經過脫蛋白脫色后得到多糖， 將發酵各時期的多糖含量進行比較（杜涓，2020；吳娟，2019）。根據葡萄糖標準曲線的回歸方程：y=0.5711x+0.1442，R2=0.9981（圖1），得出釀酒酵母發酵降解不同時期銀杏葉多糖含量為8.97%、9.54%、10.43%、11.18%。 由圖2 可見，經釀酒酵母發酵降解的銀杏葉多糖含量高于未發酵的銀杏葉，且隨著發酵時間的延長，銀杏葉中的多糖含量逐漸增加。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 釀酒酵母發酵降解銀杏葉多糖的單糖組成分析 各種標準單糖作為混標， 測定出釀酒酵母發酵后的銀杏葉多糖的單糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，在這其中葡萄糖和甘露糖占比較多， 在釀酒酵母不斷發酵的過程中， 葡萄糖比例逐漸下降而甘露糖比例不斷升高（表1）。 釀酒酵母發酵降解過程中，單糖組成由葡萄糖為主轉變為以甘露糖為主發酵改變了銀杏葉多糖中某些單糖的含量（施婭楠，2019），可能與釀酒酵母菌生長所產生的酶系以及代謝過程有關（彭繼燕，2017）。

2.3 釀酒酵母發酵銀杏葉多糖的抑菌性研究本研究選擇生活中常見的代表性細菌， 金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌 （杜成濤，2020），考察了不同濃度的釀酒酵母發酵后的銀杏葉多糖溶液對三種指示菌的抑制能力， 結果如表2 所示。

表2 釀酒酵母發酵多糖溶液對指示菌的抑菌圈直徑 mm

通過測定三種指示菌抑菌圈的直徑來判斷釀酒酵母發酵后的銀杏葉多糖溶液的抑菌能力（莫曉寧，2019）。由表2 可見，四個釀酒酵母發酵多糖溶液濃度中，除了空白試驗，各個濃度的多糖溶液對三種指示菌均有抑菌圈且直徑與對照組相比均顯著增大， 說明釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖溶液都有抑菌能力。 濃度高的釀酒酵母發酵多糖溶液對三種指示菌的抑菌圈直徑較大， 濃度低的釀酒酵母發酵多糖溶液對三種指示菌的抑菌圈直徑較小， 這說明本研究制備的釀酒酵母發酵的銀杏葉多糖對三種指示菌均有不同程度的抑菌作用，釀酒酵母發酵的銀杏葉多糖溶液濃度越高，抑菌能力越強。

2.4 釀酒酵母發酵銀杏葉多糖的抗氧化活性測定

2.4.1 不同發酵時期銀杏葉多糖的氧自由基抑制率 圖3 為鄰苯三酚法測定不同發酵時期銀杏葉多糖的抑制氧自由基的結果。在圖3 中可以看出，各個發酵時期的銀杏葉多糖都具有抑制氧自由基的能力，而且釀酒酵母發酵降解銀杏葉后，多糖的氧自由基抑制率會逐漸升高。

圖3 鄰苯三酚法測定不同發酵時期銀杏葉多糖的氧自由基抑制率

2.4.2 不同發酵時期銀杏葉多糖的羥自由基抑制率 圖4 為釀酒酵母發酵降解過的銀杏葉多糖的Fenton 法抗羥自由基活性的測定結果。 由圖4 可知，Fenton 體系中不同發酵時期銀杏葉多糖都有清除羥自由基的能力， 而且釀酒酵母發酵降解銀杏葉后，隨著發酵時間延長，多糖的羥自由基清除率會逐漸升高。

圖4 Fenton 體系中不同發酵時期銀杏葉多糖的羥自由基清除率

3 結論

苯酚-硫酸法測定結果表明， 經過釀酒酵母發酵降解72 h 的銀杏葉多糖含量由8.97%提高到11.18%。通過對釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖中的單糖進行種類鑒定， 其單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖。 抑菌性試驗結果表現出不同濃度的釀酒酵母發酵銀杏葉多糖對三種指示菌都有抑菌作用，與對照組相比，其抑菌圈均顯著增大，釀酒酵母發酵過的銀杏葉多糖溶液的濃度越高，抑菌能力越強，濃度為25 mg/mL 的釀酒酵母發酵多糖溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為7.37 mm， 濃度為75 mg/mL 的釀酒酵母發酵多糖溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為10.71 mm。 抗氧化試驗結果顯示， 釀酒酵母發酵降解不同時期的銀杏葉多糖都具有抑制氧自由基和清除羥自由基的能力，經過釀酒酵母發酵降解后的銀杏葉多糖溶液抑制氧自由基和清除羥自由基的能力更強。