不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃菌群與瘤胃發酵參數的影響

趙曉靜， 劉嫣然， 李曉輝， 張 峰， 高艷霞，左曉磊， 王曉芳， 何團擁， 孫鳳莉 ， 張建設， 申 棟

（1.保定職業技術學院畜牧獸醫系，河北保定 071051；2.河北省畜牧獸醫研究所，河北保定 071000；3.正定縣南樓鄉農業綜合服務中心，河北正定 050800；4.河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050000；5.河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000；6.石家莊市畜產品和獸藥飼料質量檢測中心，河北石家莊 050041；7.石家莊市藁城區畜牧工作總站，河北藁城 052165）

飼料是奶牛生存和生產的物質基礎，尤其是優質的粗飼料，是奶牛重要的營養來源，對于維持奶牛瘤胃健康、提高飼喂效果和乳品質均有重要的作用。 然而，隨著飼料原料價格的大幅度上漲，尤其是優質苜蓿價格居高不下，牧場經營壓力增大。運用動物營養學原理，優化日糧設計，可減少高價苜蓿干草的用量。要達到良好的飼喂效果，必須能夠穩定或優化瘤胃內環境，改善瘤胃發酵。 瘤胃是奶牛發揮生產性能的關鍵，瘤胃微生物與奶牛是共生關系，奶牛瘤胃為數量龐大的微生物菌群提供了理想的環境。瘤胃內的微生物是消化植物纖維的主要貢獻者，其數量和種類受年齡（彭科蘭等，2019）、飼養方式（沈芳等，2022；楊碩等，2020）、 飼料種類、 飼喂制度 （李建國，2012）等諸多因素的影響，瘤胃內環境與奶牛采食的日糧組成和結構密切相關，改善優化瘤胃微生物菌群可以提高反芻動物生產中瘤胃發酵和飼料利用的效率。

目前， 對瘤胃菌群與瘤胃發酵調控的研究主要包括甘露寡糖（郭婷婷等，2018）、低聚異麥芽糖（郭成等，2018）、果寡糖（胡丹丹等，2018）等益生元的使用，酵母培養物（Carpinelli 等，2021；Halfen等，2021）等益生菌（劉程等，2020）的使用及中草藥（任曼等，2022；潘龍等，2015）作為綠色添加劑的使用，此外也有一些關于發酵粗飼料的使用（謝建林等，2021）。 關于不同精粗比日糧的研究及不同飼草型日糧對瘤胃菌群影響及效果主要集中在對羊的研究上（霍俊宏等，2020），在奶牛上的研究相對較少。 燕麥干草和苜蓿干草是當前奶牛養殖中兩種常用的優質粗飼料，在相同飼養標準下，飼草類型不同的日糧纖維組成以及含量不同， 進而調控瘤胃微生態環境，會引起生產性能的差異（程思源，2022）。因此，本研究采用三種不同粗料組成的TMR 日糧配方來飼喂泌乳中后期奶牛，以燕麥干草組合過瘤胃賴氨酸、 蛋氨酸添加劑替代部分高質量苜蓿干草， 補充蛋白質的不足， 平衡氨基酸， 探討替代方案條件下對奶牛瘤胃微生物菌群和原蟲構成及其豐度、瘤胃發酵參數的影響，旨在為規模化牧場實現低（無）苜蓿日糧的精準營養、精細飼喂提供指導和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計 本試驗選用健康的泌乳中后期荷斯坦奶牛45 頭，在牛場原有分群基礎上，按照產奶量、胎次、泌乳天數相近的原則，分為3 組，每組15 頭牛（每組15 個重復，每個重復1 頭牛），試驗分組及處理見表1。

表1 試驗分組及處理

1.2 飼養管理與日糧組成 飼養試驗于2021 年11 月16 日至2022 年1 月18 日在河北冀豐動物營養科技有限責任公司進行，預飼期7 d，試驗期56 d。各組奶牛采用相同的飼養管理模式，均采用散欄式飼養，每日于06:00 和18:00 兩次飼喂全混合日糧（TMR），自由采食，投料量根據剩料量調整，按采食量的105% 投料；每天推料，自由飲水；每日于06:00 和18:00 兩次擠奶。

試驗前采集各飼料原料， 進行實驗室常規養分檢測，參照NRC 2001 標準配制TMR，三個試驗組TMR 組成及營養水平見表2。

表2 各試驗組奶牛TMR 組成及主要營養水平

1.3 樣品采集與測定 每組選擇奶牛5 頭，于試驗結束當天晨飼前， 使用瘤胃液采樣器采集瘤胃液， 用滅菌的4 層紗布進行過濾， 瘤胃液分為5份，1 份現場測定pH，使用Denver UB-7 型pH 計測定；1 份分裝于10 mL 滅菌離心管，凍存于液氮中，帶回實驗室于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于瘤胃微生物菌群及原蟲的測定， 應用16S rRNA基因測序技術測定瘤胃微生物菌群及原蟲的構成及豐度；其余3 份也分裝于10 mL 離心管，按下列要求處理好后于-20 ℃冰箱中保存，1 份加入6 mol/L 的HCl 用于氨態氮（NH3-N）的測定，NH3-N濃度參照Weatherburn 用比色法測定；其余2 份用于微生物蛋白（MCP）及揮發性脂肪酸（VFA）(包括乙酸、丙酸、丁酸）等瘤胃發酵指標的測定，MCP 濃度參照Makkar 等（1982）方法測定；VFA 濃度參考Erwin 等（1961）方法測定，計算總揮發性脂肪酸（TVFA）濃度和各VFA 的摩爾比例。

1.4 統計分析 試驗數據采用Excel 2000 進行平均值及標準差的計算， 數值用 “平均值±標準差”的形式表示；再用IBM SPSS Statistics 20 軟件中分析/一般線性模型/單變量進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群的影響

2.1.1 門水平 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在門水平相對豐度的影響見表3。三組試驗牛瘤胃液中檢測到的數量前10 的菌門，包括擬桿菌門、厚壁菌門、纖維桿菌門、螺旋體屬、變形菌門、SR1、Tenericutes、TM7、Verrucomicrobia、藍藻細菌。 三個試驗組樣品中所含的細菌門主要為擬桿菌門、厚壁菌門和纖維桿菌門，均占到了總細菌的90%以上。 與苜蓿組對比，過瘤胃氨基酸組和燕麥組有提高擬桿菌門豐度的趨勢， 燕麥組厚壁菌門豐度明顯降低（P < 0.05），其他各組間差異不顯著（P > 0.05）；對藍藻細菌豐度的影響，過瘤胃氨基酸組顯著高于苜蓿組（P < 0.05），燕麥組極顯著高于苜蓿組（P < 0.01），過瘤胃氨基酸組與燕麥組差異不顯著（P > 0.05）；纖維桿菌門、螺旋體屬、 變形菌門、SR1、Tenericutes、TM7、Verrucomicrobia 和其他菌群的豐度三個試驗組均無顯著差異（P > 0.05）。

表3 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在門水平相對豐度的影響（top10） %

2.1.2 屬水平 三組試驗牛瘤胃液中檢測到的數量前10 的屬水平細菌相對豐度見表4。 可見，奶牛瘤胃中屬水平的細菌中普雷沃氏菌屬的豐度最高， 過瘤胃氨基酸組和燕麥組較苜蓿組有提高的趨勢，但未達顯著水平（P > 0.05）。 丁酸弧菌屬豐度苜蓿組最高，顯著高于燕麥組（P < 0.05），其他組間對比差異不顯著（P > 0.05）。 琥珀酸菌屬、纖維桿菌屬、瘤胃球菌屬、密螺旋體屬、YRC22、Coprococcus、CF231 及梭菌科-梭狀芽孢桿菌屬的豐度差異均不顯著（P > 0.05）。 除數量前10 的屬水平細菌外的其他細菌總數顯示， 苜蓿組含菌量顯著優于燕麥組（P < 0.05），過瘤胃氨基酸組與苜蓿組和燕麥組差異均不顯著（P > 0.05）；但在細菌數量上過瘤胃氨基酸組與苜蓿組接近。

表4 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在屬水平相對豐度的影響（top10） %

2.2 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃原蟲的影響 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃原蟲的影響見表5。 奶牛瘤胃內原蟲主要是纖毛亞門。 結果顯示， 瘤胃內纖毛亞門及其他原蟲豐度在三個試驗組間均無顯著差異（P > 0.05），但過瘤胃氨基酸組較其他兩組有升高的趨勢。

表5 瘤胃原蟲分類學組成分析

2.3 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃發酵參數的影響 由表6 可見， 三個試驗組的奶牛瘤胃pH 差異不顯著（P > 0.05），均在6.50 ~ 6.70，為正常范圍。 NH3-N 濃度，過瘤胃氨基酸組和苜蓿組極顯著優于燕麥組 （P < 0.01）；MCP 濃度苜蓿組最低，燕麥組極顯著高于苜蓿組（P < 0.01），過瘤胃氨基酸組較苜蓿組有升高的趨勢 （P >0.05）。 在TVFA 產量方面，過瘤胃氨基酸組極顯著優于苜蓿組和燕麥組， 較苜蓿組和燕麥組分別增加52.71%和37.05%（P < 0.01）；在乙酸產量方面， 過瘤胃氨基酸組較苜蓿組和燕麥組分別增加52.32%和41.04%（P < 0.01）， 苜蓿組與燕麥組比較差異不顯著（P > 0.05）；丙酸產量，過瘤胃氨基酸組> 燕麥組> 苜蓿組，過瘤胃氨基酸組和燕麥組極顯著高于苜蓿組（P < 0.01），過瘤胃氨基酸組顯著高于燕麥組（P < 0.05）；丁酸產量方面，過瘤胃氨基酸組顯著高于苜蓿組和燕麥組（P < 0.05），苜蓿組與燕麥組無顯著差異（P > 0.05）；戊酸產量方面， 過瘤胃氨基酸組極顯著高于苜蓿組 （P <0.01），顯著高于燕麥組（P < 0.05），苜蓿組與燕麥組差異不顯著（P > 0.05）；異丁酸、異戊酸產量在各試驗組差異均不顯著（P > 0.05）。

表6 不同日糧組成對泌乳中后期奶牛瘤胃發酵參數的影響

3 討論

3.1 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群的影響 奶牛瘤胃寄居著大量微生物，種類甚為復雜，主要有細菌、真菌（厭氧真菌）、原蟲（纖毛蟲）三大類，瘤胃微生物對食物分解和營養物質的合成起著極其重要的作用， 然而瘤胃菌群在一定程度上受到飼料種類、 飼糧組成和結構等眾多因素的影響（Hao 等，2021）。本試驗中奶牛瘤胃中優勢菌門是擬桿菌門和厚壁菌門， 二者豐度占到瘤胃細菌總數的90%左右。 擬桿菌門、厚壁菌門、纖維桿菌門可降解飼料中的碳水化合物，擬桿菌門主要降解淀粉、 蛋白質和多糖等非纖維物質（Naas 等，2014），產生丙酸；厚壁菌門和纖維桿菌門促進胃腸道對纖維素分解，產生乙酸（La 等，2018）。 本試驗中，擬桿菌門豐度燕麥組> 過瘤胃氨基酸組> 苜蓿組， 此趨勢正好與日糧中NDF和FNDF 的含量趨勢一致， 日糧中NDF 和FNDF濃度與瘤胃中擬桿菌門豐度的關系， 有待進一步研究。 瘤胃中厚壁菌門豐度苜蓿組顯著優于燕麥組， 過瘤胃氨基酸組與苜蓿組厚壁菌門豐度差異不大， 說明過瘤胃氨基酸對奶牛瘤胃液中厚壁菌門的豐度影響不大。 纖維桿菌門的豐度燕麥組>苜蓿組> 過瘤胃氨基酸組，各組之間雖然差異不顯著，但燕麥組偏高的NDF 可能是導致該菌數量增加的因素，因而更有利于降解纖維，這與胡丹丹等（2018）觀點一致。 藍藻菌門能進行產氧性光合作用，在本研究中，燕麥組豐度顯著優于苜蓿組，過瘤胃氨基酸組與苜蓿組和燕麥組并無顯著差異， 說明偏高NDF 日糧有利于藍藻細菌的生長，這與霍俊宏等（2020）低精粗比日糧更利于藍藻細菌生長的觀點一致。

本試驗中奶牛瘤胃中優勢菌屬是普雷沃氏菌屬，祁有鵬等（2021）研究報道，普雷沃氏菌屬是肉牛瘤胃菌群中的優勢菌屬，二者研究結果一致。該菌在本試驗中三個試驗組奶牛瘤胃中占到46.89%、44.31%和52.49%，其次是琥珀酸菌屬、纖維桿菌屬和瘤胃球菌屬； 其他菌屬豐度均低于2%。 普雷沃氏菌屬可分解半纖維素、蛋白質和非纖維碳水化合物；瘤胃球菌、纖維桿菌屬和產琥珀酸擬桿菌是重要的分解纖維素的細菌。 普雷沃氏菌屬主要發酵產生乙酸、丙酸和琥珀酸；產琥珀酸擬桿菌分解纖維素產生琥珀酸，進而轉化為丙酸。由于丙酸是主要的發酵產物之一， 反芻動物可由其得到葡萄糖作為能量物質以供機體利用。 纖維分解菌可在飼料進入瘤胃后的5 min 內植入植物碎片的表面，日糧中有足夠氨的條件下迅速增殖，因而能夠促進纖維粗飼料的有效利用。 丁酸弧菌屬也是奶牛瘤胃中的纖維降解菌屬， 在本試驗中不是優勢菌屬， 苜蓿組該菌屬豐度雖然表現出了優勢，但與過瘤胃氨基酸組并無顯著差異。

3.2 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃原蟲的影響 奶牛瘤胃微生物區系及組成極為復雜，原蟲主要是纖毛亞門， 其種類和數量受瘤胃內容物稀釋率和外流速率、 飼糧類型等多種因素的影響。王夢芝等（2009）試驗表明，日糧結構可改變瘤胃發酵，進而影響原蟲種群結構和吞噬速率。原蟲吞噬速率與日糧NDF 含量間呈三次方曲線關系，吞噬速率與細菌（原蟲）密度呈負（正）相關關系，種屬間差異顯著， 有的隨NDF 含量降低而增高，有的則相反。吐爾遜阿依·賽買提等（2018）研究表明， 高粗纖維飼糧可顯著提高塔里木馬鹿瘤胃原蟲的活力， 不同纖維水平飼糧對瘤胃原蟲總數影響不大。本試驗結果表明，在NDF 相當的條件下，不同粗料組成的TMR 對瘤胃內纖毛亞門及其他原蟲組成及豐度并未造成顯著影響。 魏小蘭等（2021）分析認為，瘤胃原蟲對奶牛營養物質代謝有利有弊， 有利表現在纖毛蟲能夠穩定瘤胃pH，防止瘤胃酸中毒；原蟲可利用纖維素，分解不溶性蛋白，改善蛋白品質，降低硝酸鹽、亞硝酸鹽致毒，預防動物中毒。 弊端在于原蟲通過吞噬細菌和真菌合成氨基酸，使微生物的氮產量降低；原蟲在奶牛反芻過程中與氧接觸， 原蟲的自溶代謝造成氮的無效循環；瘤胃發酵過程中增加了甲烷產量，加大了能量損失。楊寶鈺等（2021）研究發現，原蟲種屬很多，數量呈凹凸形式變化，采食前奶牛瘤胃原蟲數量相對較高，采食后稀釋了胃內容物，原蟲數量緩慢降低，新的可利用的營養物質進入瘤胃，原蟲數量又增加，維持在一個動態范圍內。 可見，對瘤胃原蟲區系、種類、數量進行合理的控制，充分發揮原蟲有利生理功能，能調控瘤胃發酵，改善生產性能。

3.3 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃發酵參數的影響 瘤胃液pH、NH3-N 和VFA 是評價飼料在瘤胃中發酵的重要參數。 瘤胃pH 容易受到日糧性質、采食后測定時間和環境溫度的影響，pH 穩定在6.0 ~ 7.0， 為瘤胃發酵創造良好條件（李建國和高艷霞，2012）。飼料中碳水化合物以及含氮物質的降解主要由細菌（纖維降解菌）和原蟲來完成。 本試驗中， 各試驗組奶牛瘤胃液pH 為6.50 ~ 6.70，在正常的范圍之內，使纖維分解菌等微生物正常工作，可以保證良好的瘤胃發酵。

NH3-N 是利用飼料中蛋白質、非蛋白氮合成微生物蛋白（MCP）的重要中間物質，瘤胃內適宜的NH3-N 濃度有利于MCP 的合成。本試驗中，過瘤胃氨基酸組和苜蓿組奶牛瘤胃中NH3-N 濃度極顯著優于燕麥組，而燕麥組的MCP 極顯著高于過瘤胃氨基酸組和苜蓿組，可能與燕麥組TMR 中相對較低的CP 和相對優勢的擬桿菌門豐度有關，一方面TMR 中CP 低，瘤胃微生物分解產生的NH3-N 相對較少，另一方面通過優勢擬桿菌降解淀粉、蛋白質等物質，大大提升了MCP 的合成效率。 過瘤胃氨基酸組和苜蓿組奶牛的NH3-N 濃度差異不顯著，合成的MCP 濃度差異也不顯著，可能與這兩組TMR 中CP 稍高有關，瘤胃液中微生物將其降解為NH3-N，為瘤胃微生物提供較多的氮源。

VFA 是反芻動物對碳水化合物消化吸收的最終產物， 碳水化合物在奶牛瘤胃內被降解為單糖，再進一步降解為VFA，包括乙酸、丙酸、丁酸等及CO2、甲烷，再被瘤胃壁吸收被機體所利用。粗飼料發酵產生的乙酸比例較高，乙酸、丁酸是奶牛生成乳脂的主要原料； 精飼料發酵產生的丙酸較多，丙酸比例提高，會增加體脂肪沉積（李建國，2012）。本試驗中，在TVFA 和乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的產量方面， 過瘤胃氨基酸組均表現出了顯著的優勢，為奶牛提供更多能量。

4 結論

綜上所述， 各試驗組奶牛瘤胃液pH 穩定在正常范圍之內，有利于瘤胃發酵。在門水平和屬水平，三個試驗組優勢菌群的組成相同，只是菌的占比稍有差異， 過瘤胃氨基酸組和苜蓿組的優勢菌群的相對豐度均優于燕麥組， 過瘤胃氨基酸組和苜蓿組的優勢菌群差異不顯著。在TVFA 和乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的產量方面，過瘤胃氨基酸組均表現出了顯著的優勢。

在本試驗條件下，綜合評定認為，以燕麥干草組合過瘤胃賴氨酸、 蛋氨酸添加劑替代部分高質量苜蓿干草的TMR 日糧飼喂泌乳中后期奶牛，穩定了瘤胃菌群和瘤胃發酵微生態環境， 適當降低了干草質量， 用過瘤胃賴氨酸和蛋氨酸補充了蛋白質的不足，可以在生產中推廣應用。