大豆凝集素對兔小腸組織的氧化應(yīng)激與炎癥因子的影響

梅勝堯， 張逸民， 高慶發(fā)， 張玉堂

（江蘇省藥物研究所有限公司江蘇省藥物安全性評價中心，江蘇南京 210018）

大豆因其營養(yǎng)價值高被廣泛應(yīng)用于食品和飼料行業(yè)，但在實際應(yīng)用過程中，由于大豆中存在抗?fàn)I養(yǎng)因子，在很大程度上限制了其使用。大豆凝集素作為主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一， 對胃腸道具有嚴(yán)重的不良影響，例如影響胃腸道消化酶，且因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，大豆凝集素可與腸上皮結(jié)合，造成腸道黏膜的結(jié)構(gòu)破壞（Zhao 等，2011）。 大豆凝集素通過影響整合素α2、α6 和β1， 導(dǎo)致豬腸上皮細(xì)胞的周期阻滯， 進(jìn)而介導(dǎo)抗腸細(xì)胞增殖的作用（Pan 等，2017）。 此外，食用大豆凝集素還會導(dǎo)致機(jī)體其他組織器官的損傷， 如導(dǎo)致大鼠體內(nèi)脂質(zhì)耗竭，造成小腸和胰腺過度生長，在飼喂大豆凝集素的大鼠中還觀察到脾臟和腎臟生長不良（Zang 等，2006）；隨著大豆凝集素劑量的增加，抗體IgG 和IgM 水平也隨之下降， 說明大豆凝集素以劑量依賴的方式干擾細(xì)胞和體液免疫功能（Tang 等，2006）。 兔既是皮、毛與肉多用的特種經(jīng)濟(jì)動物，也是科學(xué)研究過程中的實驗動物。兔的腸道健康對于兔的養(yǎng)殖要求以及經(jīng)濟(jì)價值與科研價值的利用至關(guān)重要。已有研究表明，大豆凝集素通過L 型鈣通道介導(dǎo)兔空腸細(xì)胞分泌膽囊收縮素（Jordinson 等，1998）。分離純化的兔小腸上皮細(xì)胞表面含有大量大豆凝集素靶位點(diǎn)， 增加細(xì)胞培養(yǎng)基中的大豆凝集素濃度， 可促進(jìn)兔小腸上皮細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞成熟分化程度，增大細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而破壞細(xì)胞屏障功能（劉飛飛，2011）。此外，日糧添加大豆凝集素影響兔腸道糖基化（車東升和秦貴信，2016）。動物試驗表明，大豆凝集素?fù)p害了水生動物烏蘇里擬鲿的免疫和抗氧化能力，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及其腸道和肝臟中細(xì)胞因子的異常表達(dá)（Bai 等，2022）。 由此可見，大豆凝集素可損傷兔腸道健康，但其是否影響兔腸道的氧化還原狀態(tài)以及炎癥水平還不清楚。 因此，本試驗旨在探究大豆凝集素對新西蘭白兔腸道組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)以及炎性細(xì)胞因子的影響，為探明大豆凝集素在兔養(yǎng)殖生產(chǎn)與科學(xué)研究中的影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 參考Zang 等（2006）的方法，通過親和層析法制備純化的大豆凝集素， 即經(jīng)過（10%，m/V） 石油醚脫脂處理后用磷酸鹽PBS 提取，48 ℃條件下持續(xù)攪拌，48 ℃下離心取上清液，加入固體硫酸銨達(dá)到85%的飽和度使提取物沉淀，將沉淀物重新溶解在磷酸鹽緩沖液中，采用透析法去除硫酸銨雜質(zhì)，透析液過柱，采用含D-半乳糖的磷酸鹽緩沖液洗脫， 大豆凝集素的洗脫液用蒸餾水透析， 然后冷凍干燥并在48 ℃下備存。經(jīng)過大豆凝集素的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分析，大豆凝集素得率為0.96%。

1.2 試驗飼糧 參考蔡景義等（2022）的新西蘭白兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制基礎(chǔ)飼糧， 基礎(chǔ)飼糧的主要組成原料為玉米、豆粕、甜菜粕、小麥麩以及苜蓿草粉等，基礎(chǔ)飼糧為直徑約2.5 mm 的顆粒狀，飼糧組成與營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗兔飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)兔籠中，按照每2 只/籠的密度進(jìn)行飼養(yǎng)，12 h 光照與12 h 黑暗，自然通風(fēng)，舍內(nèi)溫度（22±3）℃，相對濕度40%~ 70%。 自由采食，自由飲水，并按常規(guī)免疫接種。

1.4 試驗設(shè)計 選取健康的35 日齡斷奶新西蘭白兔30 只，體重為（725.45±20.10）g，隨機(jī)分為3組，每組10 只。0 mg/kg 大豆凝集素組的兔灌胃生理鹽水，17.5 mg/kg 與87.5 mg/kg 大豆凝集素組的兔分別按17.5、87.5 mg/kg 的劑量灌胃大豆凝集素。試驗期10 d。試驗結(jié)束后，腹腔注射過量麻醉處死，立即打開腹腔，分別取出小腸組織，按十二指腸、空腸以及回腸進(jìn)行節(jié)段分離， 所有樣品裝入密封口袋，標(biāo)記，即刻放入-80 ℃冰箱保存，備用。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定 將備存的兔十二指腸、空腸、回腸樣品，在預(yù)冷的生理鹽水中洗去腸道內(nèi)容物，剪碎，加入PBS，在低溫超速勻漿機(jī)中勻漿，離心后分離上清液。每個樣本取一部分上清樣品，先采用BCA 蛋白測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行蛋白濃度測定；同時取另一部分上清樣本，采用商品化生化測定試劑盒（南京建成生物工程研究所） 按照廠家說明書要求測定小腸T-AOC、SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量。

1.5.2 炎癥因子的測定 按照1.5.1 的方法制備待測樣本上清液， 先取一部分上清樣品進(jìn)行蛋白濃度測定，再取另一部分上清樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司） 按照廠家說明書要求測定小腸TNF-α、IL-6 以及IL-1β 含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗結(jié)果表示為 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）”。 運(yùn)用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行單因素方差（One Way ANOVA） 分析，并用LSD 進(jìn)行事后檢驗，比較組間數(shù)據(jù)差異。P <0.05 表示差異顯著，P ＞0.05 表示無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆凝集素對兔小腸組織氧化應(yīng)激的影響 由表2 可見， 與0 mg/kg 大豆凝集素組相比，87.5 mg/kg大豆凝集素組兔十二指腸、空腸及回腸的T-AOC能力分別降低了31.96%、49.27%、36.35%，MDA含量分別顯著升高了217.84%、132.46%、74.29%（P < 0.05）。 與0 mg/kg 大豆凝集素組相比，87.5 mg/kg 大豆凝集素組兔十二指腸、 空腸的SOD 活性分別降低了22.05%、45.51%（P < 0.05）。 另外，87.5 mg/kg 大豆凝集素組兔空腸和回腸的GSHPx 活性顯著低于0 mg/kg 大豆凝集素組， 分別降低了36.73%、29.69%（P < 0.05）。 17.5 mg/kg 大豆凝集素組兔的十二指腸、 空腸和回腸的T-AOC、SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量與0 mg/kg 大豆凝集素組無顯著性差異（P ＞0.05）。

表2 大豆凝集素對兔小腸組織氧化應(yīng)激的影響

2.2 大豆凝集素對兔小腸組織炎性因子的影響由表3 可見，與0mg/kg 大豆凝集素組相比，87.5mg/kg大豆凝集素組兔空腸的IL-6 含量顯著升高了21.12%（P < 0.05），17.5 mg/kg 和87.5 mg/kg 大豆凝集素組兔回腸的TNF-α 含量明顯增加 （P <0.05）， 分別增加了55.23%、65.73%。 17.5 mg/kg 和87.5 mg/kg 大豆凝集素對兔十二指腸的TNF-α、IL-6 與IL-1β 含量沒有顯著影響（P ＞0.05）。87.5 mg/kg大豆凝集素組兔回腸中的IL-6 以及空腸、回腸中的IL-1β 高于0 mg/kg 大豆凝集素組，但無顯著性差異（P ＞0.05）。

表3 大豆凝集素對兔小腸組織炎性因子的影響

3 討論

3.1 大豆凝集素對兔小腸組織氧化應(yīng)激的影響活性氧包括超氧化物陰離子、 過氧化氫、 單線態(tài)氧、羥基自由基和MDA 等，可通過氧化代謝、線粒體生物能和免疫功能在體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生， 它們參與細(xì)胞的進(jìn)展、生長、死亡和分化（Tan 等，2018）。活性氧是氧化應(yīng)激中的核心物質(zhì)。正常情況下，細(xì)胞中的氧化還原狀態(tài)趨于平衡， 然而在細(xì)胞遇到外部異常氧化性刺激后， 導(dǎo)致細(xì)胞的氧化還原失衡。 在此過程中，大量的活性氧產(chǎn)生，而抗氧化的酶活性受損，導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。氧化應(yīng)激在疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。 近些年， 動物腸道氧化損傷一直是廣受關(guān)注的研究熱點(diǎn)（Abu 和Hassan，2022；Chen 等，2022；Sundaram等，2003）。 SOD 和GSH-Px 是保護(hù)細(xì)胞免受ROS損害的關(guān)鍵抗氧化酶。 在腸道中SOD 和GSH-Px等抗氧化酶活性降低， 致使氧化還原信號破壞正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)， 攝入的食物和微生物亦可誘導(dǎo)上皮和免疫或炎癥細(xì)胞的氧化損傷和胃腸炎癥反應(yīng)（Bhattacharyya 等，2014）。SOD 可將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫， 然后過氧化氫酶再將之催化為水和氧氣，從而消除ROS 并保護(hù)細(xì)胞免受過氧化氫的損害（Kwon 等，2022；Li 等，2021）。 GSH-Px 是重要的自由基捕獲酶之一， 不僅具有清除自由基和衍生物的作用， 還能減少脂質(zhì)過氧化物的形成（Taysi 等，2019）。 T-AOC 反映了各種抗氧化物質(zhì)、抗氧化酶等（如抗氧化物酶、維生素C 以及谷胱甘肽等）構(gòu)成的總抗氧化能力，是體現(xiàn)保護(hù)細(xì)胞以及組織免受活性氧自由基造成的氧化損傷（Meng 等，2022）。 另外，MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，該指標(biāo)可反映脂質(zhì)損傷程度（Elmaksoud 等，2021）。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量87.5 mg/kg 的大豆凝集素抑制了兔十二指腸、 空腸及回腸的抗氧化酶活性，并增了腸道組織的膜脂質(zhì)損傷程度，而低劑量（17.5 mg/kg）的大豆凝集素對兔十二指腸、空腸及回腸的氧化應(yīng)激程度影響較小。

3.2 大豆凝集素對兔小腸組織炎性因子的影響TNF-α、IL-1β 以及IL-6 屬于典型的促炎性細(xì)胞因子（Kapoor 等，2011）。 IL-1β 有較強(qiáng)的促炎作用，誘導(dǎo)包括細(xì)胞因子、趨化因子等在內(nèi)多種促炎物質(zhì)的產(chǎn)生，而且其可通過針對不同細(xì)胞發(fā)揮廣泛的炎癥反應(yīng)，在先天性免疫應(yīng)答中起重要作用（Weber 等，2010）。 在局部炎性反應(yīng)中，IL-1β信號放大導(dǎo)致促使黏附因子大量表達(dá)，激活淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞， 炎癥反應(yīng)程度也被進(jìn)一步加重。 IL-1β 信號通路的激活在參與促炎反應(yīng)中發(fā)揮著樞紐作用， 因為該信號會繼續(xù)引起IL-6 的分泌增加， 更進(jìn)一步激活I(lǐng)L-6 與其受體的級聯(lián)信號反應(yīng)。這些促炎因子大量分泌加劇炎性細(xì)胞分泌功能的同時損傷組織結(jié)構(gòu)并影響正常的細(xì)胞機(jī)能。 此外，TNF-α 也是一種常見的促炎細(xì)胞因子， 屬于TNF 配體超家族的重要成員之一（Zelova 和Hosek，2013）。TNF-α 影響動物機(jī)體的發(fā)育、免疫等生理功能，包括炎癥、脂質(zhì)代謝和細(xì)胞死亡等（Borish 和Steinke，2003）。 TNF-α 參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展， 包括感染性疾病與慢性代謝性疾病等。 本研究揭示了高劑量（87.5 mg/kg）大豆凝集素上調(diào)了兔空腸的IL-6 表達(dá)， 而17.5 mg/kg和87.5 mg/kg 大豆凝集素均增加了兔回腸的TNF-α 含量；另外，高劑量大豆凝集素僅稍微提高了回腸中IL-1β 的水平。 不同腸段的炎性細(xì)胞因子變化不一致， 可能與不同腸段的免疫細(xì)胞密度或者大豆凝集素分布的濃度等因素存在差異有關(guān)。而且TNF-α、IL-1β 和IL-6 這些因子常受NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子信號途徑調(diào)控 （Hu 等，2020；Yuan 等，2016），推測大豆凝集素可能通過干擾了NF-κB 信號通路影響兔小腸的炎性反應(yīng)。 另外，已有報道闡述了大豆凝集素可以破壞動物腸道組織結(jié)構(gòu)（馮琳等，2011）。 因此，大豆凝集素也可能是通過破壞小腸黏膜屏障， 導(dǎo)致病原微生物的感染， 引起腸道組織的氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在兔的養(yǎng)殖過程中，攝入過高含量的大豆凝集素可以誘發(fā)小腸組織的氧化應(yīng)激，加重腸道的炎性反應(yīng)，損害兔的腸道健康。