地衣芽孢桿菌產芽孢培養基和培養條件的優化

董 雪， 劉曉露， 李麗蓓， 劉嫵妍， 雷 浩， 樊 霞

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京海淀 100081；2.陜西秦云農產品檢驗檢測股份有限公司，陜西渭南 714000）

目前，我國飼料行業已進入綠色高質量發展新階段。 2019 年，農業農村部發布第194 號公告，規定從2020 年7 月1 日起， 飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，飼料行業正式邁入“禁抗”新紀元。 基于飼料全面禁抗的背景，飼料中的“替抗”產品蓬勃發展，微生態制劑亦列其中，成為研發熱點，《2021 年全國飼料工業發展概況》顯示我國微生態制劑型飼料添加劑產量同比增幅達17.4%，行業發展迅速。

飼用微生物亦稱飼用益生菌、 微生態制劑，《飼料添加劑品種目錄》（2013）及其修訂版中列出了34 種綠色無毒、健康環保、增效顯著的功能性微生物允許在飼料生產中使用，主要包括酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌、部分光合細菌和少數曲霉（王秋菊等，2018）。 芽孢桿菌在生物體和環境中廣泛存在，是飼養環境中的天然菌群，由于能夠產生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等功能性酶，因此在農業、醫藥衛生及工業等領域具有重要應用價值（雷新雨等，2021；潘慧青等，2019）。 與傳統的益生菌相比， 以芽孢休眠體形式存在的芽孢桿菌具有更強抗逆性，耐高溫、耐酸堿、耐擠壓、貨架期長，生產成本低于乳酸菌和酵母菌，適用范圍廣，進入養殖動物消化系統后也能保持高度的穩定性（Cheng等，2021；Popov 等，2021）。 枯草芽孢桿菌 （于潔等，2020）、地衣芽孢桿菌（陳雪穎等，2022）、凝結芽孢桿菌（喬欣君，2021）等為目前養殖過程中使用最廣泛的三種益生芽孢桿菌。

地衣芽孢桿菌作為生產飼用芽孢桿菌制劑的主要菌種之一，其發酵能夠產生肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類等多種抗菌物質，產出的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶具有良好的活性， 在保持養殖動物腸道微生態系統平衡、 提高動物機體抗病能力等方面均具有顯著作用（Muras 等，2021）。 但目前市場中菌劑制品最大的限制是易受溫濕度等儲存條件的影響，產品保質期較短，若使用時有效活菌數未能達到標準規定值（1.0×109CFU/mL 或g）將會影響作用效果， 故大部分產品在生產過程中會通過篩選培養基和培養條件來提高有效成分，或通過工藝優化和添加保護劑等方式減少產品有效活菌數的衰亡等（Wang 等，2021；Dianawati 等，2013）。 孫標等（2021）通過優化發酵工藝獲得凝結芽孢桿菌產芽孢最佳培養基組分和培養條件，最終產芽孢數達到2.848×1010CFU/mL，相比優化前提高了61.72%。趙甜宇等（2020）在研究枯草芽孢桿菌固態菌劑制備工藝時， 通過單因素和正交試驗獲得最適芽孢形成的液態發酵培養基組成與培養條件，芽孢數最高可達1.1×1010CFU/mL。 Su等（2019） 在解淀粉芽孢桿菌搖瓶發酵中優化工藝使芽孢產量提高了25.7 倍， 濕基質芽孢濃度達到7.24×1010CFU/g。

本研究采用單因素和正交試驗的方法對地衣芽孢桿菌CICC 20514 產芽孢發酵培養基組成和培養條件進行優化， 旨在提高發酵液中芽孢數量及比例， 為后續地衣芽孢桿菌制品的開發及延長相應產品貨架期奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與材料 TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司），ZWY-100H 恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），GI54DWS 高壓滅菌器（廈門致微儀器有限公司），AC2-4S1 生物安全柜（新加坡ESCO 科技有限公司），CX33 生物顯微鏡（日本OLYMPUS 株 式 會 社），SHP-080 生 化 培 養 箱 等（上海精宏試驗設備有限公司）。

地衣芽孢桿菌（編號：CICC 20514）購自中國工業微生物菌種保藏中心；牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、營養肉湯、營養瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）；蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖蜜、磷酸氫二鉀、碳酸鈣（北京索萊寶科技有限公司）；硫酸錳、硫酸鎂（上海麥克林生化科技有限公司）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）。基礎發酵培養基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、K2HPO44 g/L、MnSO40.4 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長曲線測定 將地衣芽孢桿菌CICC 20514 接種于營養瓊脂平板37 ℃培養18 ~ 24 h，取平面培養物加無菌生理鹽水制成約108CFU/mL菌懸液， 以5%接種量接種于50 mL 無菌營養肉湯中，置于37 ℃，220 r/min 恒溫搖箱中培養。 以生理鹽水為空白對照， 每隔4 h 測定種子液的OD600nm值，每個處理重復3 次。

1.2.2 地衣芽孢桿菌測定 活菌數： 將發酵液按10 倍稀釋法制成不同濃度稀釋液， 選擇2 ~ 3 個連續的適宜稀釋度，吸取0.2 mL 接種于營養瓊脂平板內，涂布棒涂布，每個稀釋度接種2 個平板。待接種物被培養基完全吸收， 倒置平皿水平放于（37±1）℃培養箱中培養（48±2）h，進行菌落計數。

芽孢數：將發酵液按10 倍稀釋法制成不同濃度稀釋液， 選擇2 ~ 3 個連續的適宜稀釋度，置（80±1）℃水浴10 min，冷卻至室溫后吸取0.2 mL接種于營養瓊脂平板內，涂布棒涂布，每個稀釋度接種2 個平板。待接種物被培養基完全吸收，倒置平皿水平放于（37±1）℃培養箱中培養（48±2）h，進行菌落計數。

芽孢率/%=芽孢數（CFU/mL）/活菌數（CFU/mL）×100。

1.2.3 碳源成分及濃度篩選 基礎發酵培養基其他成分不變，以10 g/L 的果糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖蜜代替葡萄糖篩選碳源成分。 將已 篩 選的 最 佳 碳 源 按 照5、10、15、20、25、30 g/L濃度添加，篩選產芽孢最佳碳源濃度。

1.2.4 氮源成分及濃度篩選 在單因素篩選的最佳碳源及濃度基礎上，以10 g/L 的蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、玉米漿、豆粕、花生餅粉代替基礎發酵培養基中的混合氮源，篩選氮源成分。將已篩選的最佳氮源按照5、10、15、20、25、30 g/L 濃度添加，篩選產芽孢最佳氮源濃度。

1.2.5 無機鹽成分及濃度篩選 在已篩選的最佳碳氮源及濃度基礎上， 分別用1、3、5、7、9 g/L 的K2HPO4和NaCl，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的Mn-SO4、MgSO4和CaCO3， 代替基礎發酵培養基中的無機鹽成分，篩選無機鹽成分及濃度，選擇具有促芽孢生成效果的無機鹽及其濃度進行正交試驗，篩選最優搭配組合。

1.2.6 接種量篩選 以發酵產芽孢培養基最優搭配組合為基礎， 按1%、3%、5%、7%、9%接種量將種子液接種發酵培養基中，37 ℃，220 r/min 培養48 h 篩選最佳產芽孢接種量。

1.2.7 裝樣量篩選 按10%、15%、20%、25%、30%裝樣量將發酵培養基置500 mL 錐形瓶中， 以最佳接種量接種種子液，37 ℃，220 r/min 培養48 h 篩選最佳產芽孢裝樣量。

1.2.8 發酵液初始pH 篩選 按最佳裝樣量配制發酵培養基后， 用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 調節發酵培養基pH 至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 后滅菌，按最佳接種量接種種子液，37 ℃，220 r/min 培養48 h 篩選最佳產芽孢初始pH。

1.2.9 發酵培養時間篩選 以NY/T 1461-2007《飼料微生物添加劑 地衣芽孢桿菌》 中培養時間48 h 為依據，分別將48、60、72、84、96 h 作為發酵培養時間進行活菌和芽孢計數， 篩選最佳產芽孢發酵培養時間。

2 結果

2.1 生長曲線測定 地衣芽孢桿菌以5%接種量接種至50 mL 的營養肉湯，37 ℃，220 r/min 條件下培養36 h，生長曲線如圖1 所示。0~4 h 生長緩慢，為延滯期；4 ~ 20 h 大量增殖，為對數生長期；20~36 h 趨于平穩，為穩定期。 為獲取較高濃度種子液且保持菌株的生長活力，通常選用對數生長末期和穩定生長前期進行發酵液的接種，因此本研究選擇16~20 h 作為種子液培養終止時間。

圖1 地衣芽孢桿菌CICC 20514 生長曲線

2.2 產芽孢培養基成分及濃度篩選

2.2.1 碳源成分及濃度篩選 碳源是微生物碳架的組成部分， 也是多數微生物生長不可缺少的營養物質。 本研究將10 g/L 葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉和糖蜜作為培養基的碳源，以芽孢數和芽孢率為指標進行篩選， 結果如圖2 所示。不同碳源對產芽孢數和芽孢率具有顯著影響，其中蔗糖最低且低于對照培養基，以果糖、可溶性淀粉和玉米淀粉為碳源的發酵培養基的芽孢數顯著高于其他處理組（P < 0.05；圖2A），此三組間雖差異不顯著，但以果糖為碳源的發酵培養基芽孢率明顯高于玉米淀粉和可溶性淀粉，符合擴大生產和研究目的， 因此確定果糖為地衣芽孢桿菌CICC 20514 發酵產芽孢培養基的最佳碳源。 再以果糖為碳源進行最佳濃度篩選，結果如圖2B 所示。 發酵液中芽孢數在5 ~ 25 g/L 果糖濃度內差異不顯著（P>0.05），其中20 g/L 芽孢數最高，30 g/L 濃度下芽孢數顯著下降。 從芽孢率結果可知，隨果糖濃度的升高芽孢率整體呈下降趨勢， 其中5 g/L 芽孢率最高，10~20 g/L 相近， 其中20 g/L 芽孢率相對最高，25~30 g/L 芽孢率很低； 同時考慮到活菌數對芽孢率計算的影響，5 g/L 果糖的活菌數為濃度梯度中最低，故最終選擇20 g/L 果糖作為最佳碳源濃度。 整體結果也可以說明果糖為速效碳源，能夠直接供給菌體所需營養物質，促進活菌增殖，但過高的糖濃度對后期芽孢的形成有抑制作用。

圖2 碳源及濃度菌落計數篩選結果

2.2.2 氮源成分及濃度篩選 氮源是微生物構成菌體蛋白和DNA 等含氮物質的必要營養成分。 本研究預試驗發現，無機氮源對CICC 20514 地衣芽孢桿菌產芽孢無明顯促進作用， 因此選用蛋白胨、酵母浸粉、玉米干漿、花生餅粉、豆粕6 種有機氮源進行發酵培養基的氮源篩選。不同氮源對發酵液中芽孢數的影響見圖3A。 添加有機氮源的處理組芽孢數和芽孢率均高于對照組，其中以酵母浸粉為氮源的培養基發酵后的芽孢數最低且與其他處理組呈顯著性差異，以蛋白胨、牛肉浸粉和玉米干漿為氮源的培養基發酵后的芽孢數無顯著性差異，以花生餅粉和豆粕為氮源的培養基促芽孢生成效果明顯高于其他處理組（P < 0.05），但以豆粕為氮源的培養基發酵后的芽孢數及芽孢率平均值較高，因此選用豆粕作為最佳氮源。隨后對豆粕的添加濃度進行對比，結果見圖3B。 隨著豆粕濃度的升高，發酵液芽孢數和芽孢率均呈先上升后下降的趨勢，其中在15 ~ 20 g/L 濃度間芽孢數差異不顯著 （P >0.05）， 但20 g/L 豆粕濃度的芽孢率遠高于15 g/L，故選用20 g/L 豆粕作為最佳氮源濃度。

圖3 氮源及濃度菌落計數篩選結果

2.2.3 無機鹽成分及濃度篩選 無機鹽是菌體在生長和繁殖過程中不可缺少的生理活性物質，其中金屬離子在一定濃度范圍內可以促進芽孢形成。本研究以20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕為基礎分別添加5種不同濃度的無機鹽進行促芽孢生成效果的比較，結果如圖4 所示。 與對照組相比K2HPO4和NaCl均具有明顯促芽孢生成作用，且隨著添加濃度的升高芽孢數和芽孢率均呈先上升后下降的趨勢，最佳產芽孢濃度均為5 g/L。MgSO4在0.4~0.8 g/L 濃度下芽孢數明顯高于對照組，CaCO3在0.4 ~ 1.0 g/L濃度下對芽孢生成有明顯促進作用，兩者作用效果穩定性良好，芽孢數均在0.6 g/L 達到最高值。 Mn-SO4在本研究中與對照組差異較小（P>0.05），該濃度范圍促芽孢生成作用不明顯。

圖4 無機鹽及濃度菌落計數篩選結果

根據單因素試驗結果， 為進一步提高芽孢數量，以20 g/L 果糖和20 g/L 豆粕為基礎，分別選取K2HPO4、CaCO3、NaCl 和MgSO4進行L9（43）正交試驗，因素水平設計及結果見表1。 芽孢數極差排序為RD>RB>RC>RA，最佳搭配組合為A2B2C3D3，芽孢率極差排序為RB>RD>RC>RA， 最終的優化方案也為A2B2C3D3。 表2 方差分析結果顯示， 無機鹽CaCO3、K2HPO4和MgSO4均對發酵液芽孢數量 有顯著性影響， 且主次因素為CaCO3＞K2HPO4＞Mg-SO4； 表3 方差分析結果表明， 無機鹽CaCO3和K2HPO4對發酵液芽孢率有顯著影響，影響作用為K2HPO4＞CaCO3。

表2 無機鹽正交試驗芽孢數結果方差分析

表3 無機鹽正交試驗芽孢率結果方差分析

綜上，芽孢數和芽孢率的最佳發酵液無機鹽搭配組合均為A2B2C3D3，未在正交試驗表中，需進行驗證試驗， 因A 因素極差較小， 可將A1B2C3D3、A3B2C3D3、A1B3C3D3試驗方案與正交表中芽孢數和芽孢率最高的A2B2C3D3進行比較， 選擇最優組合。驗證試驗結果如圖5 所示，地衣芽孢桿菌產芽孢發酵培養基的最佳搭配組合為A2B2C3D3，即20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕、7 g/L NaCl、5 g/L K2HPO4、0.8 g/L CaCO3和0.8 g/L MgSO4。

圖5 正交搭配組合菌落計數篩選結果

2.3 產芽孢培養條件優化

2.3.1 接種量篩選 不同接種量對發酵液產芽孢數量也具有一定影響， 本研究設置5 個梯度接種量，結果見圖6，在1%~9%接種量，芽孢數和芽孢率均隨接種量的增加呈先上升后下降的趨勢，其中5%接種量的芽孢數最多，3%和7%接種量與之相比差異不顯著 （P > 0.05）；1%接種量的芽孢率最低，3%~9%接種量的芽孢率相近，其中5%接種量的芽孢率最高，故芽孢桿菌的最佳接種量為5%。

圖6 接種量對芽孢數和芽孢率的影響

2.3.2 裝樣量篩選 本研究采用錐形瓶（500 mL）進行裝樣量的試驗，容器剩余空間大小可能也對芽孢率和芽孢數產生影響，結果見圖7。隨著裝樣量的增多， 產芽孢數和芽孢率均呈現逐漸下降的趨勢，裝樣量在10%~20%芽孢數和芽孢率均無顯著性差異且明顯高于其他處理組（P < 0.05），為方便后續發酵液的大量收集，研究的最佳裝樣量為20%。

圖7 裝樣量對芽孢數和芽孢率的影響

2.3.3 發酵液初始pH 篩選 發酵液初始pH 對地衣芽孢桿菌產芽孢能力的相關研究較少， 本研究對此因素進行探討，結果如圖8 所示。產芽孢數和芽孢率在pH 6 ~ 8 均呈現先下降后上升趨勢，發酵液初始pH 維持在6.5 ~ 7.5 芽孢數量和芽孢率較高，且三組間結果間差異不顯著（P > 0.05），初始pH 在6 和8 時產芽孢能力均顯著低于三組中性條件， 說明芽孢桿菌產芽孢能力在中性條件下比較穩定， 偏酸性或偏堿性都會減弱其產芽孢數量和芽孢率。

圖8 初始pH 對芽孢數和芽孢率的影響

2.3.4 發酵培養時間篩選 地衣芽孢桿菌生長曲線測定時發現36 h 的發酵液中芽孢數量較少，因此本研究自發酵培養48 h 開始取樣并持續觀察至發酵培養的96 h。 結果如圖9 所示。 發酵液終止培養時間在48 ~ 72 h 芽孢數量無明顯差異（P> 0.05）， 芽孢率也無明顯差異，84 ~ 96 h 發酵液芽孢數量和芽孢率均有所下降， 本著節能提效的宗旨，本研究選用48 h 作為發酵終止培養時間。

圖9 發酵培養時間對芽孢數和芽孢率的影響

3 討論

自然界微生物生長依賴于天然營養物，而實驗室或企業通常選擇人工合成的培養基來獲得目標微生物， 不同的微生物所需營養物質種類和濃度有很大差異， 因此需要通過一定的科學方法篩選和優化培養基配方， 以找到適宜特定微生物生長繁殖并獲得目標產物的營養組分和比例（李金榮等，2022）。 Khardziani 等（2017）研究影響枯草芽孢桿菌孢子產量關鍵因素時發現， 葡萄糖及濃度對芽孢形成能力的表達起著至關重要的作用。 魏強等（2019）優化地衣芽孢桿菌10236 發酵條件發現最佳碳源是葡萄糖，葡萄糖是大多微生物能夠直接利用的單糖， 本研究以提高CICC 20514 地衣芽孢桿菌的產芽孢數量為目標，對培養基組成進行優化，在篩選碳源時發現果糖和可溶性淀粉同樣能有效促進芽孢萌發，且效果均優于葡萄糖。 對于地衣芽孢桿菌CICC 20514 產芽孢碳源以果糖為最佳， 說明針對不同的目標產物， 所需最佳碳源種類有所不同。 本研究在鏡檢過程中還發現，以可溶性淀粉為碳源的發酵培養基部分菌體出現自溶現象，且后續進行重復試驗時產芽孢數量不穩定，回收率差。 地衣芽孢桿菌不能直接利用可溶性淀粉為能量來源， 淀粉酶分解可溶性淀粉為單糖有益于微生物充分利用。 本研究中以可溶性淀粉為碳源的發酵培養基產芽孢性能不穩定，或許與地衣芽孢桿菌在發酵過程中產生淀粉酶的時間和數量有關，但具體原因有待進一步研究。

氮源是構成生物體蛋白質、核酸和其他含氮化合物的主要物質。 有研究表明有機氮源含有豐富的營養成分和未知的生長因子， 更能促進菌體的生長， 而無機氮源營養成分相對單一常常需要輔助多種營養物質才能達到較好的利用效果（陳志超等，2022）。 本試驗僅對CICC 20514地衣芽孢桿菌進行了產芽孢培養基有機氮源的篩選， 結果顯示花生餅粉和豆粕均具有良好的促芽孢生成效果， 原因可能是花生餅粉和豆粕富含多種氨基酸和維生素， 這些營養物質可作為生長因子， 對菌體的生長和芽孢的萌發有特殊的促進作用。Su 等（2019）研究表明，在優化解淀粉芽孢桿菌培養基過程中加入少量玉米粕、豆粕和麥麩有利于菌株的生長， 這些富含淀粉和蛋白質固體基質不僅是營養物質， 也是細菌增殖的載體，本研究結果與之相同。

無機鹽是菌體生長繁殖過程中調節生理活性作用的物質， 主要功能包括構成菌體組成成分、作為酶的激活劑或抑制劑、調節培養基的pH和滲透壓等， 其種類和含量對菌體生長和代謝產物的生成具有很大影響（嚴凌斌等，2020）。 本試 驗 采 用K2HPO4、NaCl、MnSO4、MgSO4和CaCO3進行了產芽孢發酵培養基無機鹽組成的研究，結果顯示Na+、K+、Ca2+、Mg2+均對地衣芽孢桿菌產芽孢具有促進作用，梁棟等（2018）表示，Ca2+是影響芽孢數量的顯著性因素， 常與芽孢核心成分2，6-吡啶二羧酸 （DPA） 形成螯合物Ca2+-DPA，促進芽孢萌發。 多篇文獻報道，Mn2+有促進微生物生長和芽孢萌發的作用， 但在本研究中無明顯效果， 可能是CICC 20514 地衣芽孢桿菌對Mn2+的需求和其他菌株不同 （楊旭等，2022；Ren 等，2018）。

除培養基組成影響微生物生長繁殖外，培養條件也是決定微生物是否能夠高效生產目標產物的關鍵因素（余萍等，2021）。 本試驗初步研究了接種量、初始pH、裝樣量和發酵終止時間對地衣芽孢桿菌CICC20514 產芽孢效果的影響，結果顯示過多或過少的接種量均會影響發酵液產芽孢數量， 適當的接種量可以有效縮短發酵產芽孢周期。 裝樣量的改變通常代表溶氧濃度，裝樣量越少溶氧能力越強， 裝樣量過高則發酵液中的溶氧量不足，會影響菌體生長繁殖。 張璐璐等（2015）研究球孢白僵菌發酵工藝時使用250 mL錐形瓶進行試驗，裝樣量20%為最佳，本研究以500 mL 錐形瓶研究裝樣量的影響， 也是20%為最佳。 培養基初始pH 的改變會影響微生物的生長和代謝，Singh 等（2022）研究表明，地衣芽孢桿菌AP1 在pH 6.5 時生物氫的產量最佳，過酸或過堿都會影響生產效果，CICC 20514 地衣芽孢桿菌在pH 過高或過低條件下產芽孢效果也有所減少，但在pH 6.5 ~ 7.5 產芽孢數量差異不明顯，本研究配制的發酵液初始pH 基本維持在中性范圍，可直接使用不需再進行調節。 不同的發酵終止時間對能否收獲到足夠數量的芽孢有著重要影響，本試驗選擇持續監測48 ~ 96 h 發酵液芽孢數量的變化， 發現在一定時間范圍內芽孢數量不隨培養時間的延長發生顯著性變化，但當發酵時間過長時，數量有所下降。 通過鏡檢發現48 ~ 72 h 發酵液中大部分芽孢呈萌發狀態，未完全脫落，84 ~ 92 h 發酵液芽孢開始脫落，成為單獨的個體， 菌體因發酵液中代謝產物的大量積累出現自溶現象， 故選用48 h 作為發酵終止培養時間。

微生物生長繁殖是一個復雜的過程，其生長過程存在多種影響因素， 這些因素之間往往存在交互作用， 通過科學的方法對特定菌株的培養基和培養條件進行優化， 使目標產物達到最大值，不僅能節省成本，也能進一步研究各因素與目標產物之間的關系。 本試驗僅對CICC 20514 地衣芽孢桿菌發酵產芽孢培養基和培養條件進行了單因素和正交試驗的篩選， 下一步將針對不同因素之間交互作用影響進行深入研究，以優化達到更好的產芽孢條件，為相關菌劑產品的制作、生產與利用提供理論支撐。

4 結論

地衣芽孢桿菌CICC 20514 發酵產芽孢培養基最優搭配組合為20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕、7 g/L NaCl、5 g/L K2HPO4、0.8 g/L CaCO3和0.8 g/L MgSO4，在37 ℃，220 r/min，接種量5%，裝樣量20%，發酵液初始pH 6.5~7.5 條件下，培養48 h，活菌數可達7.2×109CFU/mL，芽孢數達5.8×109CFU/mL，芽孢率達80%。 經重復試驗，優化后的培養基產芽孢數及芽孢率均具有良好的的穩定性， 能滿足飼用地衣芽孢桿菌制劑的研制需求。