Ghrelin表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理及細(xì)胞侵襲的關(guān)系

黃裕林,黎 妮,馬世河

(重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科,重慶 405400;2.感染科)

結(jié)腸癌是臨床上常見的一種惡性腫瘤,近年來(lái)無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外,結(jié)腸癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中都非常靠前,結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率僅排在食道癌與胃癌之后,位列第三[1]。近年來(lái)隨著生活水平的不斷提高,居民的飲食結(jié)構(gòu)中高脂肪、高蛋白質(zhì)以及高膽固醇的食物所占比例越來(lái)越高,結(jié)腸癌的發(fā)病率也在以每年約4%的速度迅速增長(zhǎng),對(duì)居民的健康造成了極大的威脅[2]。有多項(xiàng)研究結(jié)果表明,胃饑餓素(Ghrelin)及其受體在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常的結(jié)腸組織,Ghrelin能加劇結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與侵襲,促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)一步惡化[3-4]。但是關(guān)于Ghrelin加劇結(jié)腸癌惡化的機(jī)制相關(guān)研究較少,因此,本文將研究結(jié)腸癌組織中Ghrelin的表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年1月～2020年2月重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院保存的結(jié)腸癌組織標(biāo)本88例,同時(shí)選取癌旁組織(距癌邊緣>5 cm)作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn):①各組織經(jīng)病理確診;②術(shù)前未行抗腫瘤治療;③患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):合并有HIV感染、自身免疫性疾病等其他嚴(yán)重疾病。人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29,購(gòu)自凱基生物公司。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色檢測(cè):將保存的88例結(jié)腸癌組織和癌旁組織用甲醛固定,12 h后進(jìn)行石蠟包埋,石蠟包埋冰凍切片,組織切片厚度約為4 μm,給予抗原修復(fù)后行滅活操作,以防對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。在組織切片上滴加3滴 Ghrelin抗體,4℃孵育過(guò)夜后PBS洗滌3次,二抗,室溫下靜置孵育10 min,用DAB顯色后通過(guò)顯微鏡觀察染色結(jié)果,并拍照保存,若有染色,則表明Ghrelin表達(dá)為陽(yáng)性。Ghrelin抗體購(gòu)于武漢博士德生物公司,DAB顯色液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。Ghrelin表達(dá)定位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將SW480結(jié)腸癌細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組和敲低Ghrelin組并種于6孔板中,細(xì)胞接種密度為1×106個(gè)/孔,待細(xì)胞融合度為80%左右時(shí),用 Lipofectamine2000TM對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前更換為無(wú)血清培養(yǎng)液。根據(jù)分組情況進(jìn)行干預(yù),其中空白對(duì)照組僅滴入Lipofectamine 2000TM,陰性對(duì)照組滴入陰性對(duì)照的質(zhì)粒和Lipofec-tamine 2000TM混合體系,敲低Ghrelin組滴入sh-Ghrelin 質(zhì)粒和Lipofectamine 2000TM混合體系。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后,向每孔中補(bǔ)充300μl FBS,繼續(xù)轉(zhuǎn)染24 h,24 h后將培養(yǎng)基更換為DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)轉(zhuǎn)染72 h。72 h后采用qRT-PCR法檢測(cè)Ghrelin mRNA的表達(dá)。質(zhì)粒和Lipofectamine 2000TM試劑按照 1∶3 比例進(jìn)行配置。Lipofectamine 2000TM 購(gòu)于美國(guó) Invitrogen 公司。

1.2.3RT-PCR檢測(cè):取生長(zhǎng)旺盛的SW480細(xì)胞用進(jìn)行PBS沖洗,沖洗2次,Trizol法提取樣本RNA提取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系總劑量為30 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5 min,95℃變性5 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min,總計(jì)進(jìn)40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參選用β-actin,使用伯樂(lè)RT-PCR儀進(jìn)行反應(yīng)和讀取結(jié)果。短發(fā)夾 RNA序列購(gòu)于美國(guó) Invitrogen 公司,Trizol試劑購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司,PCR儀購(gòu)于上海皓莊儀器有限公司。

1.2.4Transwell檢測(cè):常規(guī)培養(yǎng)后將樣本細(xì)胞濃度調(diào)整成1.0×105個(gè)/ml,Transwell 上室每孔滴入120 μl樣本,下室則滴入450 μl 20%胎牛血清,將Transwell 小室置于37℃條件培養(yǎng),去除表面的非侵襲性細(xì)胞,滴入4%多聚甲醛進(jìn)行固定,隨后選用結(jié)晶紫染色,反應(yīng)15 min后通過(guò)顯微鏡讀取結(jié)果。Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2.5Western印跡檢測(cè):取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480,用PBS沖洗1次,滴入1 ml RIPA裂解液后,于4℃環(huán)境下離心,時(shí)長(zhǎng)為8 min,去上清后檢測(cè)蛋白純度。對(duì)蛋白樣本進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉,反應(yīng)1 h后,滴入PI3K、Akt與p-Akt抗體進(jìn)行反應(yīng),次日取出后滴加二抗 37℃孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光后讀取結(jié)果。內(nèi)參為β-actin。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸癌組織Ghrelin表達(dá)比較:在Ghrelin陽(yáng)性表達(dá)率中,結(jié)腸癌組織[63.64%(56/88)]明顯高于癌旁組織[25.00%(22/88)],差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.616,P<0.000)。見圖1。

圖1 Ghrelin表達(dá)免疫組化染色圖(DAB,×400)

2.2Ghrelin表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系:腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Ghrelin陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于其他患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不同性別、年齡患者Ghrelin陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 Ghrelin表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3各轉(zhuǎn)染組Ghrelin mRNA表達(dá)比較:敲低Ghrelin組Ghrelin mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.302±0.101)明顯低于空白對(duì)照組(1.012±0.221)和陰性轉(zhuǎn)染組(1.005±0.182,F=14.392,P<0.000)。

2.4各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力比較:敲低Ghrelin組細(xì)胞侵襲能力[(87.82±11.21)個(gè)]明顯低于空白對(duì)照組[(20.01±21.01)個(gè)]和陰性轉(zhuǎn)染組[(117.28±19.82)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.393,P<0.000)。見圖2。

圖2 Transwell檢測(cè)圖(×400)

2.5各轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)比較:敲低Ghrelin組PI3K、p-Akt相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各組Akt相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖3。

表2 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞蛋白含量比較

圖3 Western印跡檢測(cè)圖

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)發(fā)病率最高的三種腫瘤之一。流行病學(xué)的研究提示,結(jié)腸癌的發(fā)病與高動(dòng)物蛋白、高脂肪以及低膳食纖維的飲食結(jié)構(gòu)有著密不可分的關(guān)系[5]。此后又有越來(lái)越多的流行病學(xué)研究表明結(jié)腸癌更易發(fā)生在腹型肥胖以及體力活動(dòng)過(guò)少的人群當(dāng)中,但肥胖增加患結(jié)腸癌的概率的機(jī)制尚不明確[6]。Ghrelin是一種多肽,其由28個(gè)氨基酸構(gòu)成,是由日本科學(xué)家Kojima等人于1999年在小鼠以及人的胃內(nèi)分泌細(xì)胞和下丘腦弓狀核中首次發(fā)現(xiàn)[7]。近年來(lái)的諸多研究都顯示,Ghrelin及其受體在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他正常組織,這引起了關(guān)注并進(jìn)行了此次的實(shí)驗(yàn)研究[8]。

在此次研究中,免疫組化染色結(jié)果顯示,在結(jié)腸癌組織中Ghrelin的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于癌旁組織,這提示Ghrelin的高表達(dá)有可能是結(jié)腸細(xì)胞發(fā)生病變的一種標(biāo)志物 。此前的研究發(fā)現(xiàn),Ghrelin是核糖體功能維持的關(guān)鍵因子,此外,Ghrelin還能促進(jìn)DNA的復(fù)制與蛋白質(zhì)的合成,這對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖有著十分重要的意義[9]。這也就提示抑制結(jié)腸癌組織中的Ghrelin表達(dá)之后,結(jié)腸癌細(xì)胞中的DNA復(fù)制與蛋白質(zhì)的合成都將受到不同程度的抑制。有研究發(fā)現(xiàn),Ghrelin 聯(lián)合5-FU干預(yù)后人結(jié)腸癌細(xì)胞活性將高于單純5-FU干預(yù)組,其凋亡率下降,該學(xué)者認(rèn)為 Ghrelin 是人結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)性因子,可對(duì)5-FU抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行抑制,這與本組研究結(jié)果相似[10]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞的敲低Ghrelin組侵襲細(xì)胞數(shù)低于陰性轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組、組,說(shuō)明抑制Ghrelin的表達(dá)可能通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的表達(dá),從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲行為。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,是人體內(nèi)重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[11]。PI3K可以在經(jīng)歷一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)之后激活被磷酸化的Akt,被激活后的p-Akt能夠繼續(xù)調(diào)控靶基因,進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖、凋亡[12]。近幾年的多項(xiàng)研究都顯示,PI3K-Akt信號(hào)通路與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān),正常細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和癌變均與PI3K-Akt信號(hào)通路有著密不可分的關(guān)系,而在大多數(shù)腫瘤中包括結(jié)腸癌都可檢測(cè)到PI3K-Akt信號(hào)通路異常[13-14]。造成PI3K-Akt信號(hào)通路異常的原因有多種,如受到生長(zhǎng)因子過(guò)度的刺激、人體正常細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在致癌環(huán)境中等都可以導(dǎo)致PI3K-Akt信號(hào)通路的異常激活。過(guò)度異常激活的PI3K-Akt信號(hào)通路能夠抑制細(xì)胞的凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境以及營(yíng)養(yǎng)匱乏環(huán)境的耐受性,從而導(dǎo)致細(xì)胞異常并且引發(fā)癌癥的惡化。并且,目前已有多項(xiàng)研究證明,阻滯PI3K-Akt信號(hào)路徑活性可大幅抑制肝癌、胃癌細(xì)胞增殖、侵襲能力[15]。根據(jù)本研究的western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中,敲低Ghrelin組的PI3K、Akt以及p-Akt蛋白的表達(dá)程度顯著低于空白對(duì)照組以及陰性對(duì)照組,說(shuō)明抑制Ghrelin的表達(dá),會(huì)影響PI3K-Akt信號(hào)通路的活性,Ghrelin的抗凋亡功能密切相關(guān),但其具體機(jī)制在本研究中尚不明確。

綜上所述,結(jié)腸癌組織Ghrelin表達(dá)能夠影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲活性,下調(diào)Ghrelin表達(dá)可能會(huì)抑制PI3K-Akt信號(hào)路徑活性,進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力,但其具體機(jī)制尚不明確,有待于進(jìn)一步研究。