毛蕊花糖苷對阿爾茨海默病小鼠神經炎性反應及對ERK1/2-Nrf2通路的影響

曾 昕,羅 飛

(1.南充市中心醫院,四川 南充 637001;2.武漢大學藥學院)

阿爾茨海默病(AD)是老年人群癡呆的最主要原因,隨著大腦中β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊的實質沉積、神經炎性反應、tau神經原纖維纏結形成和等病變積累,AD患者最終會出現突觸喪失、神經元死亡和認知能力下降。迄今為止,仍缺乏有效治療和預防AD的方法。毛蕊花糖苷是多種藥用植物的活性成分,具有抗炎和神經保護功能。研究報道毛蕊花糖苷能促進大鼠脊髓損傷后神經元功能的恢復、抑制腦出血后的炎性反應[1]。此外,毛蕊花糖苷通過抑制活性氧產生和線粒體功能障礙,保護AD模型細胞免受Aβ25-35誘導的細胞損傷[2]。核因子相關因子-2(Nrf2)是一種抗氧化因子,其表達升高可能介導缺氧復氧心肌細胞損傷、創傷性腦損傷的保護反應[3-4]。有報道稱,在AD動物模型中Nrf2表達的改變需要激活細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2),梔子苷通過激活ERK1/2-Nrf2通路來改善AD大鼠的認知和行為功能[5]。本研究主要探討毛蕊花糖苷對AD小鼠神經炎性反應的影響,并探討ERK1/2-Nrf2通路是否參與其中。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物:C57BL/6小鼠SPF級[雄性,體重(20±2)g,SCXK(滬)2003-0003]購自上海斯萊克試驗動物有限公司,在溫度(22±2)℃,濕度(54±2)%,12 h光照與12 h黑暗交替的動物房中培養,自由采食和飲水。

1.1.2藥物:毛蕊花糖苷(純度95.2%,批號111530-201914)由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3試劑和儀器:D-半乳糖(純度99%)(AMRESCO公司,美國,貨號0637-500G);亞硝酸鈉(南京化學試劑股份有限公司,貨號7632-00-0);小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京索萊寶生物公司,貨號SEKM-0034,SEKM-0002,SEKM-0007,SEKM-0010);突觸后密度蛋白95(PSD95)兔多抗、神經元特異性核蛋白(NeuN)兔單抗、ERK1/2兔多抗、Nrf2兔多抗、膠質纖維酸性蛋(GFAP)兔多抗(abcam,美國,貨號ab18258,ab174877,ab17942,ab92946,ab7260);p-ERK1/2兔多抗(Biovision,美國,貨號3441-100)。Morris水迷宮系統(安徽正華生物儀器設備有限公司);酶標儀(Synergy HTV型)購自美國BIO-TEK公司;奧林巴斯顯微鏡(CX31-LV320型)購自杭州奧瑞健生物公司。

1.2方法

1.2.1分組和給藥方法:45只小鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量組(毛蕊花糖苷30 mg/kg)、中劑量組(毛蕊花糖苷60 mg/kg)、高劑量組(毛蕊花糖苷120 mg/kg)。模型組和試驗組參照文獻[6]方法通過腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖和90 mg/kg亞硝酸鈉建立AD小鼠模型,對照組腹腔注射等量生理鹽水。小鼠AD模型建立后,低劑量組、中劑量組、高劑量組分別以30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg毛蕊花糖苷溶液灌胃[7],給藥溶劑為20 ml/kg,連續灌胃給藥8 w;對照組、模型組給予同劑量生理鹽水。

1.2.2檢測指標和方法:①Morris法觀察小鼠的學習記憶能力[8]:實驗小鼠接受定位航行6 d,第7天撤出平臺進行空間探索實驗,即將小鼠于移除平臺象限的斜對角象限的中點背向池壁放入水中,記錄小鼠在120 s內的平臺滯留時間及穿越平臺次數。②ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平[9]:Morris實驗結束后,頸椎脫臼法處死大鼠,分離海馬組織,依照ELISA試劑盒步驟檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。③Western印跡法檢測PSD95、NeuN、p-ERK1/2、Nrf2蛋白表達[10]:RIPA法提取20 mg海馬組織的總蛋白,分析蛋白濃度后,每組取40 μg蛋白進行SDS-PAGE,轉膜后,分別孵育一抗、二抗稀釋液進行免疫反應。向膜上滴加ECL試劑顯色,凝膠成像系統曝光后,用Image J軟件測定目的條帶相對灰度值。④免疫組化法檢測GFAP表達:將實驗小鼠海馬組織制成石蠟包埋切片,脫蠟至水,血清封閉后,將稀釋的GFAP抗體滴加至切片上37℃孵育1 h,PBS洗滌,將稀釋的二抗滴加至切片上37℃孵育15 min,PBS洗滌后用DAB顯色,隨后依次復染、脫水、透明和封片,鏡下觀察切片。

1.3統計學方法:所有數據采用SPSS20.0統計學軟件進行t檢驗及單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結果

2.1毛蕊花糖苷對各組小鼠學習記憶能力的影響:與對照組比較,模型組小鼠穿越平臺次數顯著減少,平臺滯留期時間顯著縮短,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠穿越平臺次數逐漸增加,平臺滯留期時間逐漸延長,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠穿越平臺次數和平臺滯留期時間比較

2.2毛蕊花糖苷對各組小鼠海馬組織炎性反應因子的影響:與對照組比較,模型組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高,IL-10水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平逐漸降低,IL-10水平逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠海馬組織炎性反應因子表達比較

2.3毛蕊花糖苷對小鼠海馬組織中PSD95蛋白和NeuN蛋白表達的影響:與對照組比較,模型組小鼠海馬組織PSD95和NeuN蛋白表達顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠海馬組織PSD95和NeuN蛋白表達逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組小鼠海馬組織PSD95蛋白和NeuN蛋白表達的比較

表3 各組小鼠海馬組織PSD95蛋白和NeuN蛋白表達比較

2.4毛蕊花糖苷對小鼠海馬組織中GFAP表達的影響:與對照組比較,模型組小鼠海馬組織GFAP表達顯著增加;與模型組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠海馬組織GFAP表達逐漸減少。見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織中GFAP表達比較(DAB,×200)

2.5毛蕊花糖苷對小鼠海馬組織ERK1/2-Nrf2通路的影響:與對照組比較,模型組小鼠海馬組織中p-ERK1/2和Nrf2蛋白表達顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠海馬組織中p-ERK1/2和Nrf2蛋白表達逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組小鼠海馬組織ERK1/2-Nrf2通路相關蛋白表達比較

表4 各組小鼠海馬組織ERK1/2-Nrf2通路相關蛋白表達比較,n=9)

3 討論

AD是一種以認知能力持續下降和日常生活能力惡化為特征的進行性神經退行性疾病,其給人類社會帶來巨大負擔。許多中草藥已被用于改善認知功能和緩解AD相關癥狀。毛蕊花糖苷具有多種生物活性,其通過調節mTOR通路可減輕海馬CA1區神經元損傷,降低海馬氧化應激相關酶活性,改善高原低氧誘發的記憶障礙[11]。毛蕊花糖苷還可減少OGD/R誘導的細胞凋亡,腦缺血再灌注損傷起保護作用[12]。突觸可塑性降低和突觸喪失是認知功能損害的直接原因,突觸后致密物(PSD)是突觸后信號轉導和整合的關鍵物質,PSD95是突觸后膜上最豐富和重要的腳手架蛋白[13]。NeuN是一種神經元特異性核蛋白,在AD中NeuN常被用作識別神經元缺失的標志物[14]。本研究中毛蕊花糖苷治療后AD模型小鼠的穿越平臺次數增加,平臺滯留時間延長,海馬組織中PSD95和NeuN蛋白水平升高,表明毛蕊花糖苷可抑制突觸和神經元缺失,提高AD模型小鼠學習記憶能力。

在AD進展中Aβ異常集聚通常會激活神經膠質細胞,誘導炎性細胞因子產生,引發神經炎性反應,進而損害大鼠學習記憶能力[15-17]。研究指出,毛蕊花糖苷通過靶向TLR4介導的急性炎性反應來減輕腦出血癥狀[18]。此外,毛蕊花糖苷能夠改善Th22細胞紊亂,抑制系膜細胞分泌促炎細胞因子,減輕炎性反應損傷[19]。與上述抗炎作用吻合,本研究發現毛蕊花糖苷治療顯著降低AD模型小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β等促炎因子水平,提高抗炎因子IL-10水平,表明毛蕊花糖苷可抑制AD模型小鼠神經炎性反應。星形膠質細胞是AD神經炎性反應的主要細胞類型,激活型星形膠質細胞產生和釋放促炎因子,該促炎因子直接或間接作用于其他腦細胞,增強炎性級聯反應,影響AD進程[20]。GFAP是星形膠質細胞活化的標志蛋白[21-22],本研究中毛蕊花糖苷治療導致AD模型小鼠海馬組織中GFAP水平降低,表明毛蕊花糖苷可能通過抑制星形膠質細胞激活來改善AD模型小鼠神經炎性反應。

Aβ誘導的神經毒性與ERK1/2-Nrf2通路抑制有關,而ERK1/2-Nrf2通路的激活具有神經保護作用[23]。研究表明異槲皮素可防止糖氧剝奪復氧誘導的神經元細胞凋亡增加和活力下降,其機制是通過激活ERK1/2-Nrf2途徑實現的[24]。本研究發現毛蕊花糖苷治療在改善AD模型小鼠學習記憶能力、抑制神經炎性反應的同時,顯著增加海馬組織中ERK1/2磷酸化水平和Nrf2蛋白表達,表明毛蕊花糖苷對AD模型小鼠神經炎性反應的抑制作用可能與激活ERK1/2-Nrf2途徑有關。

綜上所述,毛蕊花糖苷可能通過激活ERK1/2-Nrf2通路來減輕AD小鼠神經炎性反應,提高學習記憶能力,這為毛蕊花糖苷用于防治AD提供了重要實驗依據。