模擬增溫對濕地植物凋落物分解及細菌群落的影響

謝 鵬, 劉國棟,2,*, 孫晉芳,2, 郭 超, 朱開翔, 張曉薇, 王麗麗

1 曲阜師范大學地理與旅游學院,日照 276826 2 南四湖濕地生態環境保護重點實驗室,日照 276826

植物凋落物分解是濕地生態系統中的重要過程,對濕地生態系統中的能量流動、物質循環和營養物質平衡起著關鍵作用[1-3]。凋落物分解受凋落物基質質量、氣候等非生物因子以及微生物等生物因子的影響[4-5],這些因子的微小變化都可能直接影響凋落物的分解速率,并對區域甚至全球的碳收支產生影響。微生物是凋落物分解的關鍵生物因素,它們分泌多種酶,降解凋落物,還參與氨化、硝化、固氮等過程,從而影響植物凋落物的分解過程[6]。通常認為凋落物的分解以真菌為主,細菌次之[7-8],然而細菌在凋落物分解中的作用經常被低估,已有研究表明凋落物分解中的關鍵細菌群落有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidota)等,且在凋落物分解過程中會發生一系列演替[9]。一方面,細菌群落會隨著濕地植物凋落物的分解發生時間層面上的動態變化[10],另一方面,溫度會通過影響細菌的生長發育和分解能力,改變細菌的多樣性,進而影響凋落物的分解過程和強度,從而對生態系統的結構和功能產生一系列的變化[11-12]。IPCC第六次氣候變化評估結果顯示,2001-2020年的全球地表溫度相對于1850-1900年增加了1.09 ℃ [0.95-1.20][13]。在全球氣候變暖的背景下,中國華北地區的氣候出現了明顯的暖干化趨勢,近65a來平均氣溫以0.23 ℃/10 a的速率升高[14]。氣候變暖可以通過改變濕地生態系統中細菌群落的活性,進而影響植物凋落物的分解過程,并對濕地碳儲庫功能產生影響[15-16]。因此,研究增溫對山東省南四湖濕地植物凋落物分解及細菌群落的影響,對深入了解華北地區生態系統的物質循環過程具有重要的科學意義[17]。

目前濕地植物凋落物的分解研究較多關注濕地植物凋落物表面真菌群落對氣候變化的響應,且研究區域主要集中在高緯度或高海拔地區[18],而針對我國華北地區溫帶濕地湖濱帶凋落物分解過程中細菌群落對氣候變暖響應的研究較少。因此,我們選擇山東省南四湖濕地的典型植物蘆葦(Phragmitesaustralis)和香蒲(Typhadomingensis)凋落物進行了一年半的模擬增溫實驗,旨在分析:(1)在氣候變暖的情況下,濕地植物凋落物的分解強度和凋落物基質質量如何變化?(2)在氣候變暖的情況下,濕地植物凋落物分解過程中細菌群落的結構和功能如何變化?這些研究有助于科學評價氣候變暖對湖泊濕地生態系統物質循環的影響,并為北方湖泊濕地的保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

山東省南四湖(34°30′-35°30′N,116°30′-117°30′E)位于華北平原與黃淮平原交界地帶,南北長度為125 km,東西寬度為6-25 km,周圍長度為311 km,最大的湖泊面積為1266 km2,總庫容為47億m3。南四湖不僅是我國華北地區最大的淡水湖泊,也是我國南水北調東線工程的重要蓄水區,對維持地區的經濟發展和生態平衡,起著十分重要的作用。南四湖屬于暖溫帶半濕潤的季風區域,具有雨熱交替、降水集中的特點,年平均氣溫14.2 ℃,年平均降水量700 mm。南四湖濕地湖濱帶的典型植物為蘆葦(Phragmitesaustralis)、香蒲(Typhadomingensis)等。

1.2 實驗設計

2019年9月在南四湖濕地境內微山島上搭建9套原位增溫控制系統OTC(Open-top Chamber)(底面直徑0.6 m,高度1.2 m),OTC增溫幅度由其頂口直徑控制,頂口越小增溫幅度越大,9套OTC包括3套增溫(2.0±0.5)℃(頂口直徑0.4 m)、3套增溫(4.0±0.5)℃(頂口直徑0.3 m)和3套對照(頂口直徑0.6 m)。另外,實驗期間的(2.0±0.5)℃和(4.0±0.5)℃增溫為全年平均增溫,用數據記錄器每小時記錄一次OTC內外的大氣溫度。2019年10月采集蘆葦、香蒲2種植物凋落物,在實驗室避光自然風干1個月后,分別稱取10 g植物組織制作成凋落物樣品,放入20 cm×15 cm規格的凋落物分解袋中。凋落物袋網孔大小為0.01 mm,只允許微生物進出網袋。每套原位增溫控制系統OTC中放入24袋凋落物,9個處理組共計216袋,其中,162袋凋落物測定凋落物基質質量特征,54袋凋落物測定細菌群落結構特征。凋落物袋用尼龍線系在OTC內的竹竿上加以固定,將竹竿插在實驗池的底泥中,使凋落物袋懸浮在水下10 cm處,觀測周期為1.5 a(2019.11-2021.5),每兩個月(共9次野外采樣)取回18袋凋落物進行凋落物基質質量特征測定;另外,分別在2019年11月、2020年5月和2021年5月(共3次野外采樣)各取回18袋凋落物進行細菌群落結構特征測定。

圖1 本研究的實驗設計模式圖Fig.1 Model diagram of the experimental design of this study對照Control:對照非增溫組 Control non-warming group;(2.0±0.5)℃:增溫(2.0±0.5)℃組 Warming(2.0±0.5)℃ group;(4.0±0.5)℃:增溫(4.0±0.5)℃組 Warming(4.0±0.5)℃ group

1.3 測定項目與方法

取回的部分凋落物樣品經凈化去除泥土等雜質后,在實驗室避光自然風干,然后放入65 ℃的烘箱中烘干至恒重。使用電子天平稱重并記錄質量,隨后,將樣品粉碎后過100目篩,用于總碳(Total Carbon)、總氮(Total Nitrogen)、總磷(Total Phosphorus)、纖維素(Cellulose)、木質素(Lignin)的測定分析。用重鉻酸鉀-濃硫酸氧化方法測總碳,用凱氏氮氣定量分析方法測總氮,用鉬-銻抗比色分析方法測總磷。采用經典VanSoest法測定植物組織中的酸性洗滌纖維ADF和酸性洗滌木質素ADL,然后根據以下公式計算木質素和纖維素的百分比:木質素=%ADL,纖維素=(%ADF-%ADL)[19]。

另一部分凋落物保存在-80 ℃冰箱中,用于微生物群落結構和功能活性的分析。利用快速DNA自動提取試劑盒提取細菌DNA,完成基因組DNA抽提后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。對樣品進行細菌16SrRNA基因的PCR擴增,針對細菌16SrRNA的V5-V7區域,PCR擴增所用的引物為799 F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1193 R(5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)。將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量,之后按照每個樣本的測序量要求,進行相應比例的混合。使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit試劑進行文庫構建,委托上海美吉生物(Majorbio)醫藥技術有限公司進行Illumina MiSeq測序。生成的原始序列數據已存入NCBI數據庫,生物工程編號為PRJNA938606。

1.4 數據處理與分析

用累積系數(NAI)表示總碳、總氮、總磷、木質素、纖維素的含量變化,以判斷養分總碳、總氮、總磷、纖維素和木質素在分解過程中的積累與釋放[20]:

(1)

式中:M0為凋落物的初始質量(g);Mt為凋落物分解時間內的剩余質量(g),Xt為t時間取樣的凋落物總碳、總氮、總磷、纖維素和木質素的濃度,X0為初始放樣時間的凋落物總碳、總氮、總磷、纖維素和木質素的濃度。

利用指數模型計算分解常數K[21]:

Mt/M0=e-Kt

(2)

式中:M0、Mt含義同公式(1),t為分解時間(a)。K為分解常數,表示凋落物的分解速率。

凋落物分解的溫度敏感性用Q10表示,其計算方法為[22]:

Q10=(K2/K1)(10/(T2-T1)

(3)

式中:K1和K2表示溫度T1(℃)和T2(℃)下的分解速率。

借助Origin、Matlab軟件進行數據整理、分析作圖,利用SPSS軟件對不同增溫條件的凋落物分解常數K和溫度敏感性Q10進行單因素方差分析(One-Way ANVOA)。在操作分類單元(OTU)信息的基礎上,計算細菌群落Chao、Ace、Shannon和Simpson指數,以此評估Alpha多樣性。另外,采用共現網絡分析揭示細菌群落在不同增溫條件下的共生關系。

2 結果與分析

2.1 凋落物分解期間的溫度變化

在2019年11月到2021年5月期間,對對照、(2.0±0.5)℃和(4.0±0.5)℃處理組的年平均氣溫進行測量。結果顯示,與對照組相比,(2.0±0.5)℃組和(4.0±0.5)℃組的年平均增溫幅度分別為1.9℃和3.8℃,符合大氣增溫實驗設計要求。在這段時間內,氣溫呈“W”型變化趨勢,對照組、(2.0±0.5)℃組和(4.0±0.5)℃組的最高溫度均出現在2020年7月,分別為25.3 ℃、27.9 ℃和28.9℃。對照組和(2.0±0.5)℃組的最低溫度出現在2021年1月,分別為2 ℃和4.2 ℃,(4.0±0.5)℃組的最低溫度出現在2020年1月,為6.2 ℃(圖2)。

圖2 凋落物分解期間的溫度變化Fig.2 Temperature variation during the decomposition of litter

2.2 凋落物分解過程中分解速率、溫度敏感性以及基質質量的變化

2019年11月至2021年5月的實驗過程中,不同處理組的凋落物分解常數K存在顯著差異(P=0.020<0.05),香蒲-4.0℃組的K值最大(1.45±0.59),而蘆葦-對照組的K值最小(0.68±0.36)(表1)。不同凋落物的溫度敏感性Q10差異性顯著(P=0.004<0.01),蘆葦的Q10(4.45±0.08)大于香蒲的Q10(2.54±0.18)。NAI結果顯示,香蒲-4.0 ℃組和蘆葦-對照組分別表現出最高和最低的總碳、總氮、總磷和纖維素釋放量(圖3)。同時,蘆葦-4.0 ℃組釋放了最多的木質素,而香蒲-對照組釋放了最少的木質素。此外,(4.0±0.5)℃組和(2.0±0.5)℃組的總碳、總氮、總磷、木質素和纖維素釋放量均明顯高于對照組,表明氣候變暖促進了這些養分的釋放。

表1 分解常數K和溫度敏感性Q10的方差(平均值±標準差)Table 1 Variance of the decomposition constant K and the temperature sensitivity Q10 (Mean±SE)

2.3 凋落物基質質量、溫度與凋落物分解速率的相關分析

相關分析結果表明,整個分解期的分解常數K與木質素/氮和纖維素/氮之間呈現負相關關系,相關系數分別為-0.653和-0.717;與溫度之間存在正相關關系,相關系數為0.731。0到300 d期間的分解常數K1與碳/磷、氮/磷和溫度之間存在正相關關系,相關系數分別為0.712、0.947和0.897。300 d到540 d期間的分解常數K2與木質素/氮、纖維素/氮和碳/氮之間存在顯著的負相關關系,相關系數分別為-0.827、-0.941和-0.978(表2)。

表2 分解常數的皮爾遜相關分析Table 2 The Pearson correlation coefficient of the decomposition constant K

2.4 凋落物分解過程中細菌群落的結構變化

在整個分解期間,變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicutes)等是凋落物細菌群落門水平組成中的優勢菌群(圖4)。變形菌門在2019年11月對照組的蘆葦凋落物中的豐度最高,占細菌總數量的88.9%。按照不同的增溫處理,變形菌門在對照組的豐度占比最高,為70.6%,其次為(4.0±0.5)℃組(69.8%),(2.0±0.5)℃組(61.7%)。隨著時間的推移,變形菌門的豐度呈下降趨勢,其豐度占比從73.1%(T2019)下降到68.1%(T2020),再進一步下降到65.6%(T2021)。擬桿菌門在2019年11月對照組的蘆葦凋落物中的豐度較低,占細菌總數量的8.9%。按照不同的增溫處理,擬桿菌門在(2.0±0.5)℃組的豐度占比最高,為27.7%,其次是對照組(18.9%)和(4.0±0.5)℃組(16.7%)。隨著時間的推移,擬桿菌門的豐度呈上升趨勢:從T2019到T2020再到T2021,其豐度占比依次為14.0%、21.9%和22.0%。

圖4 不同凋落物處理組的門水平細菌群落相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities at the phylum level in different litter-treated groupsA:增溫(4.0±0.5)℃ Warming(4.0±0.5)℃;B:增溫(2.0±0.5)℃ Warming(2.0±0.5)℃;C:對照 Control;1:蘆葦 Phragmites australis;2:香蒲 Typha domingensis;2019:2019年11月 In November, 2019;2020:2020年5月 In May, 2020;2021:2021年5月 In May, 2021

如圖5所示,在1.5 a的凋落物分解過程中,細菌群落的Chao、Ace和Sobs 指數在兩種凋落物中呈現出相似的趨勢,而Simpson和Shannon指數在兩種凋落物中有所差異,香蒲的細菌群落多樣性高于蘆葦的細菌群落多樣性。從分解開始(T2019)到分解結束(T2021),細菌群落的Chao、Ace和Sobs指數在分解過程中逐漸增加,而Simpson和Shannon指數在T2021時達到最高點。此外,按照不同的溫度處理,從對照組到(2.0±0.5)℃組,再到(4.0±0.5)℃組,細菌群落的Chao、Ace和Sobs指數逐漸增加,而(2.0±0.5)℃組的Simpson和Shannon指數最高。

圖5 不同凋落物處理組的細菌群落α多樣性指數Fig.5 The alpha diversity index of bacterial communities in different litter-treated groupsT2019:2019年11月 In November, 2019;T2020:2020年5月 In May, 2020;T2021:2021年5月 In May, 2021

2.5 細菌群落結構變化的影響因素

使用冗余分析(RDA)研究細菌群落對環境的響應,將環境條件分為對照組、(2.0±0.5)℃組和(4.0±0.5)℃組。RDA的前兩個軸共解釋了60.67%的細菌群落變異,其中RDA1和RDA2分別解釋了42.21%和18.46%的變異。分析結果顯示,豐度居于前五的門水平細菌有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria),其中,擬桿菌門與木質素、木質素/氮呈顯著正相關,厚壁菌門與碳呈顯著正相關(圖6)。另外,溫度因素對(2.0±0.5)℃組和(4.0±0.5)℃組的樣本產生了比對照組更顯著的影響。

圖6 凋落物中細菌群落結構的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of bacterial community structure in litter

共現網絡用于表示生態系統中不同物種之間的相互作用,包括競爭和互利共生等關系,通過建立不同溫度條件下的共現網絡,可以預測細菌群落之間的相互作用。結果表明,參與凋落物分解的細菌群落網絡在三種溫度條件下均主要由共生關系構成,其中,(2.0±0.5)℃組展現出最高的正相關程度,共生關系的正相關比例占據了71.12%(圖7),對照組和(4.0±0.5)℃組的正相關比例分別為67.59%和58.42%。(2.0±0.5)℃組的平均聚類系數最高,為1.00,(4.0±0.5)℃組的平均聚類系數高于對照組的平均聚類系數,0.86>0.54(表3)。另外,在三種溫度條件下,變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidota)是網絡中節點數量最多的菌門。

圖7 不同增溫條件下的細菌群落共現網絡Fig.7 Co-occurrence networks of bacterial communities under different warming conditions

表3 細菌共現網絡的拓撲性質Table 3 Topological properties of the bacterial co-occurrence network

3 討論

3.1 凋落物基質質量對凋落物分解的影響

凋落物基質質量與凋落物分解之間存在很強的相關性,尤其是凋落物中的碳/氮和木質素/氮是分解速率的可靠預測因子[23]。通常認為初始碳/氮、木質素/氮比值低的植物凋落物分解較快[24],其原因在于凋落物中的氮等營養物質能夠滿足凋落物中細菌的生長和代謝需求,對發揮降解作用的細菌群落活性和組成具有重要的影響[10]。凋落物中可溶性氮濃度越高,就越能滿足細菌的生長和代謝需求,從而導致細菌豐度水平的增加,并持續降低分解早期凋落物中的氮含量;而木質素具有難降解性,較高的初始木質素含量會抑制分解進程,并與分解速率呈現顯著的負相關關系[25]。在本研究中,不僅木質素會抑制凋落物分解,難分解物質纖維素同樣抑制了凋落物的分解,纖維素/氮比值越高的凋落物其分解速率越低。另外,作為細菌生長和代謝不可缺少的營養元素磷在分解早期的快速釋放促進了凋落物分解速率的提升。研究發現氮和磷對凋落物分解限制的重要性不同,通常認為氮/磷< 14時受氮限制,氮/磷> 16時受磷限制,14 <氮/磷< 16時受到氮、磷的共同限制[9]。在本研究中,前期分解速率K1與氮/磷存在顯著正相關,并且氮/磷> 16,因此,在分解前期,凋落物分解速率主要受磷的限制。

3.2 增溫對凋落物分解的影響

增溫對凋落物分解速率有顯著影響,一般情況下,凋落物的分解速率隨著氣溫的上升而增加[26-28]。崔嘉楠等人發現,增溫在分解初期促進了紅杉(Larixpotaninii)凋落物的分解,然而隨著分解時間的延長,增溫對分解后期凋落物分解速率的促進作用不顯著[29-30]。在本研究中,相較于對照處理,增溫(2.0±0.5)℃和(4.0±0.5)℃處理顯著提高了凋落物的分解速率。此外,溫度與K1呈現顯著正相關,而溫度與K2之間則相關性不大。這一發現表明,增溫對凋落物的分解具有一定的促進作用,但隨著時間的推移,這種促進作用逐漸減弱,其原因可能是分解后期木質素、纖維素等難分解物質的積累[31],另外,增溫會增加蒸散作用,從而改變參與分解的微生物群落結構并抑制相關酶的活性,進而導致分解速率減緩[29]。在本研究中,含有高木質素含量的蘆葦凋落物具有較高的Q10值,這可以歸因于其固有的凋落物化學特性,如高木質素含量以及較低的氮(TN)、鈣(Ca)和錳(Mn)等[32]。

3.3 氣候變暖對細菌群落的影響

Romani等認為,真菌能夠分泌一些催化降解頑拗物質(如木質素等)的酶[33],而細菌只是從真菌外酶降解復雜大分子過程中形成的物質中受益[34],或者為真菌提供電子或必要的微量元素,促進真菌分解凋落物[35],但細菌在凋落物分解中的作用實際上是被低估了。在本研究中,凋落物的細菌優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)等。變形菌門細菌在碳氮代謝中發揮著重要作用[36],而擬桿菌門細菌主要負責硝化過程,破壞復雜的生物大分子,與凋落物木質素和纖維素的分解有關[37]。隨著分解時間的推進,擬桿菌門等細菌群落的豐度上升,變形菌門和厚壁菌門等細菌群落的豐度下降,細菌群落中的優勢種從偏好多種碳水化合物的微生物轉變為主要分解木質素和纖維素的微生物[12]。

細菌群落對氣候變暖的響應非常敏感,較小的環境溫度變化都會影響細菌群落的結構組成、活性、生物量及胞外酶分泌過程,進而調控植物凋落物分解的整個過程[38]。Zhao等人發現,氣候變暖可以通過間接影響細菌豐度和多樣性來影響植物的凋落物分解[12]。在本研究中,增溫導致細菌群落的豐度和多樣性增加,尤其是增加了擬桿菌門細菌的物種豐度,進而促進了凋落物中木質素和纖維素的降解。細菌共現網絡中的正相關代表共生關系,而負相關代表競爭關系,細菌間的共生關系意味著某一區域內有一個完整的細菌群落,并且細菌種類間缺乏競爭[39]。在本研究中,增溫不僅提高了細菌共現網絡中的正相關比例,而且使得平均聚類系數也有所增加,這意味著氣候變暖不僅改善了細菌之間的共生關系[22],而且使得細菌群落之間的連接越來越緊密,細菌群落之間的信息交流越來越多[40]。因此,氣候變暖增加了細菌共現網絡的復雜性,從而加快了植物凋落物的分解進程,進而影響了濕地生態系統的碳收支平衡。

4 結論

南四湖濕地是一個重要的碳匯,其植物凋落物的分解與存留是碳匯功能的基礎。本研究揭示出南四湖濕地湖濱帶典型植物凋落物分解受凋落物基質質量、大氣溫度和細菌群落的綜合影響,表明氣候變暖會顯著促進南四湖濕地植物凋落物的分解,其中細菌與凋落物基質質量具有密切關聯,凋落物分解的細菌網絡主要由共生關系構成,而增溫有助于改善細菌之間的正相關和共生關系。可以預見,未來氣候變暖將進一步促進南四湖濕地植物的凋落物分解,并對濕地生態系統的物質循環和碳匯功能產生影響。然而,由于濕地生態系統中植物物種的多樣性和生境的復雜性,未來氣候變暖對濕地生態系統碳匯功能的影響具有復雜性和不確定性,相關作用機制需要進一步研究。