氟馬替尼耐藥K562細胞株耐藥機制的初步探討

肖 捷，黃繼賢，何立風，李玉權，何 瑩，喻 亮?

（1.汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院體檢中心，廣東 韶關 512025；2.汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院血液內科，廣東 韶關 512025 ；3.汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院醫學研究中心，廣東 韶關 512025 ；4.廣州醫科大學附屬第六醫院血液內科，廣東 清遠 511500）

慢性髓性白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）是成年人群最常見的白血病之一，是嚴重依賴于單一基因變異的獲得性克隆性骨髓增殖性腫瘤[1-2]。持續性激活的酪氨酸激酶途徑導致突變的造血干細胞與正常的造血干細胞相比具有增殖優勢，并逐漸取代正常造血干細胞[3]。酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosinekinase inhibitors，TKI）的應用，已經明顯改變了CML 的自然病程，顛覆了既往的傳統治療模式[4]。研究發現，充分合理使用TKI 治療的CML 患者，如能獲得良好的治療反應，其預期壽命接近正常人群[5]。然而，20 余年來的臨床實踐證明，經過第一代TKI伊馬替尼治療后有近40% 的CML 患者產生耐藥[6]，治療反應差，導致疾病進展，遠期預后不佳。甲磺酸氟馬替尼（flumatinib，FL）是我國近年來研發的、擁有自主知識產權的新一代TKI。相較于一代TKI 伊馬替尼，FL 的臨床試驗已經證實其療效更好且安全性接近[7]。因此，本課題組在前期研究成功體外誘導FL 耐藥人CML 細胞株（K562-RF）的基礎上，對其耐藥機制進行了初步探討，現報告如下。

1 主要儀器和試劑

1.1 主要儀器

PowerPac Basic 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；電子分析天平（德國Sartorius 公司）；C170i 型CO2細胞培養箱、Centrifuge 5430 R 和Centrifuge 5910 R 低 溫 離 心 機（德 國eppendorf 公 司）；MS 3 型 旋渦振蕩器和ROCKER 2D D 搖床（德國IKA 公司）；XB 100 型制冰機（寧波格蘭特制冷設備制造有限公司）；IX83 型熒光倒置生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；ECLIPSE Ts2 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Multiskan Sky 酶標儀和1300 A2 型生物安全柜（美國ThermoFisher 公司）；ALLIANCE Q9 MINI 化學發光凝膠成像系統（英國UVITEC 公司）。

1.2 主要材料和試劑

K562 細胞株從中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫購得；FL 由江蘇豪森藥業集團有限公司提供；1640 培養基和特級胎牛血清均為美國Invitrogen公司的產品；phospho-EGFR（Tyr1092）免疫標記抗體為碧云天公司的產品；多藥耐藥相關蛋白4（MRP4）單克隆抗體為Proteintech 公司的產品；GAPDH 兔一抗和二抗均為美國Cell Signaling Technology （CST）公司的產品。

1.3 方法

1.3.1 耐藥細胞株的建立、保存和復蘇 K562-RF 細胞由本課題組前期通過低濃度FL 與K562 細胞共培養獲得，傳代時逐漸增加FL 的濃度，最終誘導出耐藥濃度為53 nmol/L 的K562-RF 細胞，置于液氮罐中長期保存。在Western blot 試驗前半個月，取出液氮凍存罐中的K562 和K562-RF 細胞，在水浴箱中復蘇后再次進行培養、傳代和備用。

1.3.2 Western blot 試驗分析細胞中相關蛋白的表達

1.3.2.1 提取蛋白質 取二甲基亞砜（DMSO）和藥物處理后的K562 細胞與K562-RF 細胞，以RIPA 裂解液進行冰浴裂解，離心后提取蛋白質，通過BCA 法使用酶標儀檢測蛋白質濃度，取等量蛋白加入上樣緩沖液100 ℃金屬浴5 min 使蛋白變性后，立即置于冰浴中冷卻，并于半小時內上樣。

1.3.2.2 電泳凝膠的制備 依據蛋白分子量的分離范圍制備不同濃度的SDS- 聚丙烯酰胺凝膠，灌膠后制備10% 濃縮膠，轉移至電泳槽上樣后進行電泳。

1.3.2.3 Western blot 試驗 電泳完成后卸下凝膠板，切膠后將裁剪好的PVDF 膜蓋于凝膠上，蓋上轉膜板，置于轉膜槽漂洗后進行一抗封閉，孵育過夜，完成后進行二抗室溫孵育1 h，取出PVDF 膜，加ECL 顯色液后使用化學發光成像系統進行成像，曝光時間依據蛋白發光的靈敏度設定，獲取顯影圖像后保存。

1.4 統計學方法

研究中所得的數據通過Graphpad Prism 9.3 軟件進行作圖和分析，采用SPSS 18 軟件進行統計學差異的分析，組間比較采用t檢驗。

2 結果

Western blot 試驗結果顯示（圖1，A），經氟馬替尼處理后，K562 細胞中人磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR）的表達水平顯著降低（P＜0.01）（圖1，C），而K562-RF 細胞中p-EGFR 的表達水平雖有下降但沒有統計學差異（P＞0.05）（圖1，D）。研究結果顯示，在正常培養環境中，K562 細胞中MRP4 蛋白表達較低，而K562-RF 細胞中MRP4 蛋白表達水平與K562 細胞相比顯著增加（P＜0.01）（圖1，B），氟馬替尼處理后，K562 細胞中MRP4 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），而K562-RF 細胞中MRP4 表達則明顯下降（P＜0.05）（圖1，D）。

圖1 K562 和K562-RF 細胞中p-EGFR 蛋白與MRP4 的表達

3 討論

CML 的耐藥機制包括BCR-ABL1 依賴性和非BCR-ABL1 依賴性兩種情況。CML 患者發生BCRABL1 激酶區突變仍是目前已知獲得性TKI 耐藥的主要機制。而關于BCR-ABL1 激酶區突變導致耐藥的原因尚不清楚[8]。TKI 的治療效果取決于藥物與其分子靶點的接近程度。在藥物靶向BCR-ABL1 的過程中，足夠的TKI 藥物濃度進入CML 細胞內部對于達到治療效果是至關重要的。藥物穿過細胞膜的運動主要由藥物轉運蛋白介導[9]。TKI 在細胞中流入和藥物流出之間的平衡對TKI 抑制BCR-ABL1 起到決定性的作用，這些轉運蛋白的變化可以解釋TKI 攝取無效和/ 或TKI 從細胞中過度排出引起的耐藥現象[10]。大多數藥物自由擴散穿過細胞膜的能力較低，因為它們的運動不依賴于ATP，而是由溶質載體（SLC）轉運蛋白介導。ATP 結合盒（ABC）轉運蛋白介導代謝物、化療藥物的轉運[11]。這些轉運蛋白的過度表達可降低細胞內藥物濃度，影響其有效性[12]。我們的研究發現，K562-RF 細胞在正常培養環境下MRP4 表達較未耐藥細胞K562 顯著增強，而氟馬替尼處理后K562-RF細胞的MRP4 表達明顯減弱，但K562 細胞的表達卻顯著增強，提示MRP4 與氟馬替尼耐藥CML 細胞株的耐藥機制可能有關。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）發生磷酸化，繼而導致下游信號通路的激活，也可能與FL 耐藥CML 細胞株的耐藥機制有關。哺乳動物細胞的有絲分裂由多個蛋白激酶家族調控[13]，在復雜的調控中一些激酶的過度表達、激活或突變會導致細胞生長失控甚至轉化為腫瘤[14]。在比較K562 與K562-RF 細胞中不同信號通路中相關蛋白的表達水平過程中，我們發現氟馬替尼處理后的K562 細胞p-EGFR 表達顯著下降，而K562-RF 細胞的p-EGFR 表達下降不明顯，提示p-EGFR 與氟馬替尼耐藥CML 細胞株的耐藥機制可能有關。作為重要的生長因子受體酪氨酸激酶，EGFR 可以使細胞內外部進行通訊，從而決定有絲分裂的開始[15]。同時，EGFR 的激活也會導致轉錄因子STAT3 的磷酸化。p-STAT3 能夠進入細胞核，調節特定基因的表達，從而影響細胞的生長和存活。p-STAT3 的過度激活已被發現與腫瘤的惡性轉化、耐藥和逃逸凋亡等現象相關。這些現象提示在FL 壓力下，細胞通過增強EGFR 的磷酸化水平來適應并抵抗藥物的影響。這種耐藥性的產生可能與這些蛋白在細胞信號傳導中的關鍵作用有關。

綜上所述，本研究發現K562-RF 細胞中的耐藥相關轉運蛋白MRP4 和p-EGFR 表達水平升高，與FL耐藥可能相關。雖然本研究對氟馬替尼耐藥CML 細胞株的耐藥機制進行了初步探討，但仍有許多工作需要完成才能闡明其耐藥機制。在下一步的研究中，我們將進一步探討相關激酶信號通路的表達情況，探討和分析CML 耐藥的可能機制，探索CML 抗腫瘤治療的潛在新靶點。