HPLC法測定反應液中7-氨基頭孢烷酸的殘留

＊趙玉娟 魏寶軍* 賈金煥 馬蘇杰 張建麗

（1.華北制藥河北華民藥業有限責任公司 河北 052165 2.抗生素酶催化與結晶技術國家地方聯合工程實驗室 河北 052165 3.河北省頭孢類藥物制備技術創新中心 河北 052165 4.華北制藥河北華民藥業有限責任公司河北省企業技術中心 河北 052165）

頭孢菌素類抗生素是一類重要的抗菌藥物，抗感染效果較好，在市場中占較大比重。到目前為止，全球頭孢菌素類抗生素已擁有70多個品種，已廣泛應用于臨床治療當中。它是一種分子中含有頭孢烯的半合成抗生素，是β-內酰胺類抗生素中的7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）的衍生物，屬于β-內酰胺類抗生素[1-2]。頭孢菌素類抗生素具有以下優點：對細菌的選擇作用強，但對人幾乎沒有毒性；可破壞細菌的細胞壁，并且在繁殖期殺菌；具有抗菌作用強、抗菌譜廣、耐青霉素酶、過敏反應較青霉素類少等[3]。

7-ACA是7-氨基頭孢烷酸的簡稱，是一種重要的生物堿類藥物，是半合成抗頭孢類藥物的重要中間體，在醫藥制造和醫藥領域中具有廣泛的應用。以7-ACA作為母核與不同的物料反應，可以合成頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢克羅、頭孢哌酮鈉、頭孢吡肟、頭孢拉定、頭孢曲松鈉等頭孢菌素類抗生素產品。

雜質是藥品的關鍵質量屬性之一，在藥品生產過程及儲存期間都有可能產生，其對藥品的安全性、可靠性、有效性造成潛在影響，故雜質控制研究是一項浩大的工程，是藥品質量研究的主要內容。在《中國藥典》2020版第四部通則的《9102 藥品雜質指導原》及ICH Q3A中均指出起始物料是有機雜質之一，而作為頭孢菌素類抗生素產品母核的7-ACA的殘留量也影響著藥品質量。故在合成工藝過程中控制7-ACA殘留含量，可以更好地提高產品的質量。

1.實驗部分

(1)儀器與試藥

儀器：安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、島津LC-20AB型高效液相色譜儀（日本島津公司）、XS105DU電子天平（精度0.01mg，瑞士梅特勒-托利多公司）、FE20 pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）。

試藥：7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）對照品（批號130538-200902，含量96.9%，中國食品藥品檢定研究院）。二水和磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鹽酸（分析純）；乙腈（色譜純）；水（去離子水）。

(2)色譜條件

色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠填充柱（迪馬Diamonsil C18 4.6×250mm，5μm或能效相當），流動相為磷酸鹽緩沖液（pH7.0）-乙腈-水（V:V:V=100:60:840），檢測波長為254nm（UV），流速為1.0ml/min，柱溫為30℃，進樣量為20μl。

(3)測定過程及計算方法

精密量取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液濾液各20μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。反應液中7-ACA殘留量的計算公式如下：

式中：m對照品—對照品的重量（mg）；P對照品—對照品的含量（%）；A對照品—對照品溶液的主峰面積；N對照品—對照品溶液的稀釋倍數。

式中：f平均—對照品溶液校正因子的平均值；A供試品—供試品溶液中7-ACA峰面積；N樣—供試品溶液的稀釋倍數。

(4)溶液制備

空白溶液：

a.流動相過濾，進樣。b.純化水過濾，進樣。

7-ACA對照品貯備液：

精密稱取對照品約30mg，置100ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液溶解后，再用此緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為7-ACA對照品貯備液。

7-ACA對照品溶液：

精密移取對照品貯備液1.0ml，置50ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾。

供試品溶液：

量取反應液適量，精密移取，置含有少量有機溶劑的50ml量瓶中，依次加入10%鹽酸溶液、純化水、10%碳酸氫鈉溶液各適量，緩慢振搖使反應，再加純化水稀釋至刻度，搖勻，過濾。

加標供試品溶液：

精密移取7-ACA對照品貯備液0.8ml，置25ml容量瓶中，再用已制備的供試品溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾。

2.結果

(1)專屬性試驗

精密移取空白溶液、對照品溶液、加標供試品溶液、供試品溶液各20μl，分別注入高效液相色譜儀，對色譜圖進行分析圖1。由實驗結果可知，空白溶液對7-ACA殘留量檢測無明顯干擾，供試品溶液和加標供試品溶液中7-ACA峰保留時間（分別為8.013min、7.989min）與對照品溶液的主峰保留時間（8.037min）一致，對照品溶液、供試品溶液和加標供試品溶液中7-ACA峰純度因子分別為999.987、992.772、999.831，均大于990，說明峰純度良好；供試品溶液和加標供試品溶液中7-ACA峰與其前后相鄰峰分離度均大于1.5，符合要求，說明該測定7-ACA殘留量分析方法專屬性良好。實驗數據見表1。

圖1 典型色譜圖

表1 專屬性結果

(2)檢測限和定量限

精密移取對照品溶液逐級稀釋，配制低濃度溶液，按“1.3”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，主峰信噪比大于3時為檢測限，信噪比大于10時為定量限。試驗測得7-ACA檢測限濃度為52.12ng/ml；定量限濃度為173.72ng/ml。配制6份定量限濃度的溶液分別注入高效液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，主峰峰面積的RSD為2.0%，主峰保留時間的RSD為0.04%。

(3)線性試驗

取適量7-ACA對照品，精密稱定，置100ml容量瓶中，用適量磷酸鹽緩沖液（pH7.0）溶解，再用此緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為7-ACA對照品貯備液；精密移取7-ACA對照品貯備液，進行不同倍數的稀釋制得濃度分別為2.895μg/ml、4.343μg/ml、5.791μg/ml、7.238μg/ml、9.555μg/ml、11.582μg/ml的溶液，作為對照品的線性溶液。精密量取上述各線性溶液，分別注入高效液相色譜儀，記錄主峰面積。以對照品溶液的濃度（C，μg/ml）為橫坐標，測得各溶液的主峰面積（A，mAU）為縱坐標進行線性回歸方程。由實驗得7-ACA回歸方程：A=27.333C+2.7421。實驗結果表明，7-ACA在2.895～11.582μg/ml濃度范圍內，峰面積與濃度呈良好線性關系（100%響應值的25%為66.1410，r=1.0000）。

(4)進樣精密度試驗

將7-ACA對照品溶液注入高效液相色譜儀，記錄7-ACA峰面積，連續進樣6次。實驗結果顯示，7-ACA峰面積的RSD（n=6）為0.35%，表明本分析方法進樣精密度良好。

(5)重復性試驗

按“1.4”項下配制對照品溶液6份，依次注入高效液相色譜儀，分析色譜圖，記錄7-ACA峰面積。實驗結果顯示，7-ACA峰面積的RSD（n=6）為0.98%，表明本分析方法重復性良好。

(6)回收率試驗

取7-ACA對照品適量，精密稱定，置合適的量瓶中，用適量磷酸鹽緩沖液（pH7.0）使溶解，再用此緩沖液稀釋至刻度，搖勻。分別制備低、中、高3個水平的對照品溶液，每個水平的溶液制備3份。每份溶液分別進樣檢測，記錄色譜圖，用峰面積并計算回收率，平均回收率為96.9%（RSD=1.4%，n=9）。實驗數據見表2。

表2 回收率試驗數據

(7)溶液穩定性溶液

按“1.4”項下配制供試品溶液，室溫下放置，分別在0h、30min、80min、2h后分別進樣，記錄色譜圖。實驗結果顯示，7-ACA保留時間RSD為0.13%，供試品中7-ACA殘留含量與0h的最大差值為0.01mg/ml，供試品溶液在室溫下放置2h比較穩定。根據實驗結果及實驗的可操作性、及時性，7-ACA殘留供試品溶液配制后需及時進樣進行測定。實驗數據見表3。

表3 供試品溶液穩定性測定結果

(8)耐用性考察

為了考察色譜條件微小變動因素對7-ACA峰與其前后雜質峰分離度的影響，分別改變柱溫（25℃、30℃和35℃）、緩沖鹽溶液的pH值（6.8、7.0和7.2）以及流動相比例（105:55:840、100:60:840和95:65:840）來考察分析方法的耐用性，7-ACA峰與其前后峰的分離度均符合要求。

3.總結與討論

建立了用高效液相色譜檢測頭孢菌素類抗生素產品工藝過程中7-ACA殘留含量的分析方法，在生產過程中能夠更好地控制反應的終止點，對工業生產具有實際指導意義；同時，可以充分利用反應物料，降低生產成本；控制反應液中7-ACA含量可降低其在最終產品中的殘存量，提高產品質量。該方法具有專屬性良好，分離度滿足要求，操作簡便，精密度、穩定性、回收率均符合方法學驗證的要求，為頭孢類品種檢測母核7-ACA殘留含量提供實驗依據，能夠更好地確保產品質量。