二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物在化妝品中功效性能的研究

＊何俊杰 張目 黃曉東

（1.華南理工大學 廣東 510641 2.廣州悅薈化妝品有限公司 廣東 510080）

皮膚共生微生物的代謝活動是通過攝取皮膚細胞分泌物進行物質(zhì)與能量交換，其對維護健康皮膚有重要作用。皮膚共生菌群可以將表皮油脂分解成游離脂肪酸，調(diào)節(jié)皮膚表面酸堿度抑制致病菌的生長，釋放抗菌物質(zhì)抑制病原菌的增殖，調(diào)節(jié)宿主皮膚固有免疫防御系統(tǒng)，抵御致病生物體侵害。雙歧桿菌作為腸道共生菌群中的優(yōu)勢益生菌，對機體皮膚健康的促進作用具有獨特優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用在皮膚健康與護膚品領(lǐng)域[1-2]。雙歧桿菌發(fā)酵底物經(jīng)過滅活、超聲等方式獲得菌裂解物，即雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)物溶胞物，常稱二裂酵母發(fā)酵產(chǎn)物溶胞產(chǎn)物，可用于護膚領(lǐng)域的產(chǎn)品[3]。二裂酵母在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、維生素以及各類分子介質(zhì)，可以滋養(yǎng)、修復肌膚，補充皮膚所需養(yǎng)分，降低紫外線對皮膚細胞DNA的損傷，同時具有的抗炎、修護、緊致、抗皺、抗衰老等作用，目前二裂酵母發(fā)酵產(chǎn)物濾液和二裂酵母發(fā)酵產(chǎn)物溶胞產(chǎn)物已經(jīng)錄入《已使用化妝品原料名稱目錄》（2021版）作為化妝品原料使用[4-5]。本文從皮膚共生體系的微生物中選取出優(yōu)異雙歧桿菌進行工程發(fā)酵，獲得二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物，通過細胞活性、基因表達促進測試、自由基清除測試等體外測試方法對二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物的抗皺、緊致、抗氧化的效果進行研究。

1.實驗部分

(1)主要材料、試劑與儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析純，均買于Sigma公司；胎牛血清，F(xiàn)SP500；RNAlater溶液，R0118；DMEM培養(yǎng)基，生物級，均買于賽默飛公司。TRIzol試劑，100T，阿拉丁公司；PrimerScript RT試劑盒，RR047A，Takara公司；實時PCR試劑盒，RR420A，Takara公司。人成纖維細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

多功能酶標儀，HBS-1096A，德鐵；分析天平，BSA224S，德國賽多利斯；顯微鏡，SG-300，薩伽；紫外分光光度計，U2910，日立；PCR擴增儀，BIO-RAD，伯樂；超聲清洗機，VGT-2127QT，威固特。

(2)實驗方法

①I型膠原蛋白（CollagenI）含量測試

制備細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μL，培養(yǎng)24h。棄去孔中原培養(yǎng)液，每孔加入100μL不同質(zhì)量分數(shù)的測試樣品、陰性對照，培養(yǎng)箱孵育24h，每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4h。去除孔中液體，每孔加入150μL DMSO，置于振蕩器振蕩15min后，在酶標儀570nm波長處測定吸收值。

各組數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，以對照組細胞活性為100%，計算各組相對細胞活性（Viability）

式中：

AS：測試樣品的在450nm處吸光度；

AC：陰性對照在450nm處吸光度；

A0：空白組在450nm處吸光度。

②斑馬魚I型膠原蛋白基因（col1a1a，col1a1b,col1a2）與彈性蛋白基因（Elna）表達促進測試

參照T/HPCAI OOX—2022《化妝品抗皺、緊致功效—斑馬魚膠原蛋白、彈性蛋白基因表達測試方法》測試。

③化妝品自由基（DPPH）清除測試

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物稀釋液：取發(fā)酵產(chǎn)物原液去離子水依次稀釋為1%、3%、5%、10%水溶液作為樣品。

維生素C（VC）溶液（作陽性對照組）：使用去離子水配置為0.001g/L、0.002g/L、0.004g/L、0.006g/L、0.008g/L、0.01g/L、0.02g/L和0.5g/L的VC溶液，備用。

將樣品溶液、溶劑或DPPH溶液按等體積混合，避光常溫30min，吸取200μL移入96孔板中，在517nm檢測各組吸光度，記錄數(shù)據(jù)。將溶液混勻后，避光常溫30min，吸取200μL移入96孔板中，在517nm檢測各組吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

清除率計算公式為：

式中：

T—樣品管吸光值，即樣品與DPPH反應(yīng)后溶液吸光值；

T0—樣品本底吸光值；

C—DPPH管吸光值，即未加樣品時DPPH溶液吸光值；

C0—溶劑本底吸光值。

2.結(jié)果與討論

(1)CollagenI含量測試

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物的測試質(zhì)量分數(shù)為1%、3%、5%進行促進CollagenI含量檢測，圖1結(jié)果顯示，1%的添加量即具有促進CollagenI含量的效果，且效果隨著質(zhì)量分數(shù)的升高而提升。二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物能夠顯著促進CollagenI含量的效果，且呈劑量依賴性，因此，具有抗皺和緊致的功效。

圖1 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物不同質(zhì)量分數(shù)促進CollagenI含量測試結(jié)果

(2)斑馬魚I型膠原蛋白基因表達促進測試

前述從細胞水平說明二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具有抗皺和緊致的功效，現(xiàn)從分子水平同樣對溶胞物進行測試。斑馬魚的I型膠原蛋白分布與人體相類似，通過測試斑馬魚I型膠原蛋白基因（col1a1a，col1a1b和col1a2）表達，來評價原料或產(chǎn)品的抗皺和緊致效果[6]。

從圖2結(jié)果表明1%的添加量即對斑馬魚collalb和col1a2兩種基因表達具有顯著促進作用，促進率隨配方質(zhì)量分數(shù)提升而同步提高，當配方質(zhì)量分數(shù)提升至5%后，對斑馬魚col1a1b和col1a2基因表達的促進效果提升趨于平緩，但對斑馬魚col1a1a的促進作用效果較差。可見二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物樣品能顯著促進斑馬魚col1a1b和col1a2基因表達，可以促進I型膠原蛋白再生效果，具有抗皺和緊致的功效。

圖2 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物對斑馬魚I型膠原蛋白基因相對表達量

圖3 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物對斑馬魚彈性蛋白基因相對表達量

(3)斑馬魚彈性蛋白基因表達促進測試

彈性蛋白是人體中一種在拉伸和收縮后可以維持組織細胞原有形態(tài)，使皮膚在變形后恢復到初始形態(tài)的蛋白。該基因在斑馬魚體內(nèi)的對應(yīng)基因是Elna，通過測試樣品能否促進斑馬魚體內(nèi)Elna基因的表達，評判樣品是否有促進彈性蛋白再生，使皮膚緊致的功效[7]。

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞樣品在1%配方添加量可顯著促進斑馬魚Elna基因表達，但隨著配方添加質(zhì)量分數(shù)的提升促進效果逐漸下降。造成這種原因可能是斑馬魚完全暴露于樣本溶液中，耐受性相比人體局部皮膚低，魚胚胎會因壓力問題，導致測試結(jié)果并未隨配方質(zhì)量分數(shù)增高而效果增強。從計量分析，1%、5%和10%配方添加量下都能顯著促進斑馬魚Elna基因表達，促進彈性蛋白再生效果，二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具有較好的抗皺和緊致功效。

(4)化妝品自由基（DPPH）清除測試

DPPH乙醇溶液褪色程度與其接受的電子數(shù)呈線性關(guān)系，由此用于評判試驗樣品清除自由基的能力。圖4結(jié)果顯示，二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物在添加量1%即具有較強DPPH清除率，在添加量為3%后，DPPH清除率基本維持在較高的范圍，因此在二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物1%～10%的檢測量范圍中表現(xiàn)出較強的抗氧化性，具有較強的抗氧化效果。

圖4 二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物的DPPH清除率柱形圖

3.結(jié)論

二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物通過細胞水平的CollagenI含量測試表明，具有抗皺和緊致的功效，其次通過斑馬魚I型膠原蛋白基因表達促進實驗，從分子水平分析抗皺和緊致功效，實驗表明二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物對col1a1b和col1a2基因表達具有明顯促進作用，但對col1a1a基因的促進效果不明顯，同時可以促進斑馬魚Elna基因表達，具有可以幫助皮膚抗皺和緊致的功效，另外通過DPPH清除率實驗，發(fā)現(xiàn)二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具有較好的抗氧化效果。從皮膚共生體系的微生物中選取出優(yōu)異雙歧桿菌進行工程發(fā)酵，獲得二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物，通過細胞活性、基因表達促進測試、自由基清除的體外測試證明二裂酵母共生發(fā)酵溶胞物具備抗皺、緊致、抗氧化的效果，具有應(yīng)用在化妝品護膚領(lǐng)域的市場價值。