氧化石墨烯-殼聚糖用于中藥派特靈膜劑載體的制備與表征

＊王欣 施章浪 劉曉青 崔曼 李媛 文繼紅*

（1.吉林大學材料科學與工程學院 吉林 130012 2.吉林大學第一醫院 吉林 130021）

為了保障傳統中藥派特靈技術的推廣與應用，本工作擬分別以氧化石墨烯（GO）、殼聚糖（CS）及GO-CS為載體，以派特靈水劑為目標藥物，采用溶液共混結合溶劑蒸發法，在合適的基底上制備載藥膜劑。GO納米材料是石墨烯的衍生物，具有sp2和sp3雜化結構，片層表面和邊緣富含羥基、環氧基和羧基等含氧官能團，納米片尺寸及膠體濃度易于調控[3]。大的比表面積、優異的膠體穩定性、良好的生物相容性和生物降解性使其在納米醫藥和生物醫學領域有著廣泛的研究和應用，尤其在藥物可控釋放和靶向輸運方面，GO不僅可與傳統藥物載體復合，發揮協同載藥作用，而且有望成為一種新型的多功能藥物載體材料[3-5]。但是，目前GO作為中藥載體的研究還很少[5-6]。將GO納米片與高分子材料的結合形成復合材料，可以改善單一高分子材料的力學、熱學和電學等多種性質，提升天然或人工合成高分子材料在各個領域的應用潛力。CS是甲殼素脫乙酰基后得到的天然大分子多糖，生物相容性良好，在人體內能夠自然降解并排出體外，已廣泛應用于醫藥、食品和化工等領域。作為藥物載體，CS材料易于制備成凝膠形態或者薄膜[7]。

基于GO和CS都是優異的藥物載體材料，有著各自獨特的特性，本研究首先探討單質載體負載藥物成膜的條件，然后將GO作為添加劑與CS復合制備載藥膜，旨在保持CS優異的生物相容性、可生物降解性及藥物釋放的pH敏感特性[8]，同時改善純CS的力學性能、載藥能力和穩定性不足的問題。本研究對上述膜劑進行譜學分析和載藥性能評估，以期開發藥物新劑型，彌補傳統給藥方式的不足，方便醫患。

1.材料及儀器

（1）藥品與試劑。派特靈濃縮液（原藥液，規格為15mL/瓶，北京派特博恩生物技術集團有限公司，批注文號：（玉江）衛消證字[2018]第0001號）；天然鱗片石墨粉（325目，Alfa Aeasar公司）；殼聚糖（分子量200000，脫乙酰度≥95%，上海阿拉丁生化科技有限公司）。

濃硫酸、硝酸鈉、鹽酸、高錳酸鉀、過氧化氫、氨水（北京化工廠）；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

（2）儀器。磁力攪拌器（金壇市大地自動化儀器廠）；超聲波清洗器（深圳市華策科技有限公司）；水浴恒溫振蕩器（上海比朗儀器制造有限公司）；高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司）；傅里葉變換紅外光譜（Perkin Elmer，Spectrum One B，英國）；拉曼光譜儀（LabRAM Hr Evolution，激發波長514nm，法國）；紫外可見分光光度計（海陽光學Chemu B4000，美國）。

2.方法

(1)GO的制備

采用改良的Hummers法制備GO[9]。將2g天然鱗片石墨粉、2g硝酸鈉和96mL濃硫酸置于錐形瓶中，于0℃冰水浴中攪拌，緩慢加入12g高錳酸鉀，耗時約30min，再繼續攪拌2h；升溫至60℃，恒溫水浴攪拌12h后取出，冷卻至室溫，加入去離子水，滴加約10mL過氧化氫使其變為明黃色且無明顯氣泡產生，靜置24h后，分裝于離心管中，先酸洗3次再水洗多次直至中性；超聲分散處理約60min（功率為120W）得到GO溶液。

(2)膜劑的制備

①單質載體膜劑的制備。采用溶劑蒸發法制備GO載藥膜和CS載藥膜。量取適量GO分散液，稀釋至6mg/mL，量取稀釋后的GO分散液25mL，分別加入派特靈原液300μL、750μL、1.5mL，在加入去離子水增容至30mL，編號對應為GO-1、GO-2、GO-3，繼續攪拌混合均勻，脫氣處理后澆鑄在聚苯乙烯表面，置于60℃真空干燥箱中成膜。

式中，mp為彈體質量;vp0為彈體初始速度;d0為彈體直徑;h為侵徹深度。考慮到隨著彈體侵徹速度的增加，在超過臨界速度ver時，彈體的質量出現一定的磨蝕，彈體質量表示為

量取質量為600mg的CS粉末3份，放入錐形瓶中，倒入25mL去離子水和500μL冰醋酸，攪拌使其充分混合，再分別加入派特靈原液300μL、750μL、1.5mL，加入去離子水增容至30mL，編號對應為CS-1、CS-2、CS-3，繼續攪拌混合均勻，脫氣處理后澆鑄在聚苯乙烯表面，置于60℃真空干燥箱中成膜。

②復合載體膜劑的制備。采用溶劑蒸發法制備GO-CS復合載藥膜。量取質量為600mg的CS粉末3份，放入錐形瓶中，倒入25mL去離子水和500μL冰醋酸，攪拌使其充分混合，然后加入1mg/mL的GO水溶液1mL，再分別加入派特靈原液300μL、750μL、1.5mL，加入去離子水增容至30mL，編號分別為GO-CS-1、GO-CS-2、GO-CS-3，繼續攪拌混合均勻，脫氣處理后澆鑄在聚苯乙烯表面，置于60℃真空干燥箱中成膜。

(3)膜劑的表征

①膜劑的結構分析

傅里葉變換紅外光譜（FT-IR spectroscopy）：將制備好的膜劑充分干燥，然后裁剪成合適尺寸，測試的掃描范圍為400～4000cm-1，分辨率為2cm-1，每次掃描重復10次。

拉曼光譜（Raman spectroscopy）：將適量的派特靈原液、載體原液和負載派特靈的載體混合溶液分別移入毛細管中，測試范圍為200～3500cm-1，激發波長為514nm。

②膜劑的負載藥物分析

A.標準曲線。精密量取50μL派特靈濃縮液，進行稀釋處理，得到0.01～1.00μL/mL不同濃度的稀釋液。采用紫外可見分光光度計，在286nm波長處測量不同濃度下的吸光值；以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，線性擬合得到藥物釋放標準曲線。重復實驗三次取平均值。

B.載藥量與包封率。精密稱量5mg膜劑和5mg純載體膜樣品，剪碎，分別置于15mL的離心管中并加入PBS緩沖液10mL，搖晃1min后離心，分別吸取上清液2mL并均勻稀釋，測量膜劑的吸光值I1和純載體膜的吸光值I’1。重復實驗三次取平均值。

精密稱量5mg膜劑和5mg純載體膜樣品，剪碎，分別置于15mL的離心管中并加入10mL緩沖液，超聲溶解并離心，分別吸取上清液2mL并均勻稀釋，測量膜劑的吸光值I2和純載體膜的吸光值I’2。重復實驗三次取平均值。

將吸光值I1-I’1和I2-I’2分別代入標準曲線方程，得到相應的未包封的藥物量V1和負載的藥物量V2，通過下述公式計算載藥量（單位為μL/mg）與包封率：

藥物利用率是指膜劑中實際的載藥量與初始添加的派特靈水劑濃縮液用量的比值。

C.藥物釋放。精密稱量純載體膜5mg和膜劑5mg，放置于離心管中，加入PBS緩沖液，于37℃恒溫搖床中，以120r/min的轉速下，分別在0.5h、1h、2h、4h、8h和12h時量取2mL上清液，同時補充2mL緩沖液；將上清液稀釋至10mL，測定其吸光值。將載藥膜的吸光值中去除純載體膜的吸光值得到的差值代入標準曲線方程，即為各時間段藥物的釋放率，進而求得其累計釋放率。

3.結果與討論

(1)膜劑的光學圖片

圖1所示為三種藥物載體，即GO、CS、GO+CS負載中藥水劑派特靈制備的膜劑樣品光學圖片。膜劑具有良好的自支撐性，易于操作，膜表面光滑、膜體柔性好。其中CS膜與GO-CS復合膜透明度較好，GO與CS具有典型的陽離子-陰離子作用特性，可通過物理相互作用成膜，與水劑混合后，藥物分布均勻，表面無明顯可見非溶性藥物顆粒的聚集。

圖1 膜劑樣品光學圖片

(2)膜劑的化學結構分析

①FT-IR表征。以GO作為載體制備的三種劑量派特靈膜劑樣品的FT-IR譜圖如圖2（a）所示。其中，3420cm-1位置對應-OH的伸縮振動峰，1042cm-1和1221cm-1分別對應于烷氧基C-O 和環氧基C-O 的伸縮振動峰，1726cm-1位置對應于羰基上的C=O伸縮振動特征峰，1608cm-1位置處是吸附在GO片層間的水分子的變形振動峰[10]。負載藥物后，混合液的FT-IR譜圖的峰形和峰位基本與GO的譜圖一致，位于1042cm-1和1221cm-1處的C-O和1726cm-1處的C=O的伸縮振動峰增強，說明藥物以物理吸附方式負載在GO表面；在500～900cm-1內出現藥物指紋區是N-H彎曲振動峰，來源于藥物中的大青葉，在1480～1590cm-1內存在藥物特征區，來自于芳環，且峰強與藥物濃度存在一定對應關系。圖2（b）是CS載體與CS載藥膜的FT-IR光譜圖。其中，波數為1548cm-1對應于-NH2上的N-H的彎曲振動峰（酰胺II的吸收峰），1409cm-1為C-H的彎曲振動峰，1152cm-1為C-O-C的彎曲振動峰，1071cm-1和1024cm-1分別對應于二級醇和一級醇上的C-O的伸縮振動峰[11]。加入派特靈并沒有改變CS載體的光譜形狀和特征峰的峰位，說明加入藥物后，藥物與載體之間存在氫鍵相互作用，隨著派特靈水劑量的增加，載體特征峰強度有所降低。圖2（6）為復合載體與膜劑的FT-IR光譜圖。從圖中可以看出，由于GO的摻入量很少，所以GO-CS復合載體的FT-IR譜圖以CS特征峰為主。加入派特靈水劑后，復合膜劑的特征峰的峰位沒有發生變化，隨著載藥濃度的增加，其峰強有所減弱，變化規律類似于單一的CS載體膜劑。

圖2 樣品的傅里葉變換紅外光譜圖

②Raman表征。我們對派特靈原液、GO和CS載體及其負載藥物的混合溶液進行了Raman光譜分析，以進一步說明溶液共混方法較好保持了各載體的化學結構和藥物穩定性，結果如圖3所示。圖3（a）中，藥物原液中的主要成分大青葉、苦參、金銀花等，含有的化學物質如綠原酸（C16H18O9）中富含羧基、羥基，可對應于Raman光譜中1100～1800cm-1波數范圍；苦參堿（C15H24N2O）、靛玉紅（C16H10N2O2）含有N-H與C-N鍵，對應于3220～3320cm-1波數范圍；木犀草素（C15H10O6）內存在大量醇-OH與C-O-C，對應于2850～2950cm-1波數范圍。低劑量下的混合溶液表現出十分微弱的藥物峰，而在高劑量混合液出現明顯的藥物特征峰。負載藥物后，GO的D峰和G峰位置未發生改變，峰強ID與IG的比值（ID/IG=0.86）幾乎無變化，說明藥物的負載并沒有造成GO結構的明顯變化，藥物分子可通過π-π相互作用、氫鍵或靜電相互作用，以非化學鍵方式與GO復合。同樣，添加低劑量派特靈水劑的混合溶液表現出載體峰和藥物峰，提高劑量，藥物峰顯著增強，表現出與派特靈原液相似的光譜圖，說明混合后藥物結構穩定，如圖3（b）所示。

圖3 樣品的拉曼光譜圖

(3)膜劑的載藥性能與藥物釋放性能

表1給出了不同載體所對應的各膜劑藥物的載藥量、藥物利用率和包封率，用以衡量不同載體和不同載藥濃度下的膜劑的載藥性能。從表中可以看出，三種載體膜劑的載藥量與載藥濃度均存在正向關聯，但是藥物的最大利用率則對應于中等劑量的載藥濃度。GO載體膜劑的載藥量和包封率均高于CS載體膜劑，這與GO納米片大的比表面積為藥物的吸附提供更多的活性位點相關；GO-CS復合載體膜劑具有較好的綜合載藥特性。

表1 幾種膜劑的載藥性能

我們選取了上述具有最佳包封率的膜劑進行藥物釋放性能測試，分別測試了兩種pH條件，釋放曲線結果如圖4所示。可以看出，GO-CS膜劑的釋放曲線規律類似于CS膜劑，復合膜劑在釋放12h時未出現釋放平臺，且兩種pH下的藥物釋放率相對于CS膜劑更低，說明GO的引入提升了復合膜的緩釋性能；此外，復合膜劑的藥物釋放也存在pH敏感性，酸性環境有利于藥物的釋放。

圖4 藥物膜劑在不同pH環境下藥物累積釋放曲線

4.結論

本研究以GO和CS單質及復合材料為載體，采用溶液共混和流延涂布方法，制備了負載不同劑量派特靈原液的膜劑，并對膜劑進行了化學結構表征，分析了膜劑的載藥和藥物釋放特性。結果表明，GO-CS復合膜劑的載藥量和包封率更高，其釋放具有較好的緩釋性，未出現明顯的突釋效應。

派特靈水劑臨床使用時需棉球蘸取后放入宮頸處，約4～6h后取出，每次使用數個棉球不等。本研究所制備的單片膜劑的藥物用量較為準確，施藥無需專業人員，患者可自行上藥；膜劑具有緩釋效果，可有效減少上藥次數；用藥后，載體可生物降解。本研究表明復合膜劑制備工藝可行，具有廣闊應用前景。