趕黃草花、葉、桿中總黃酮含量及其抗氧化性比較研究

陳詩琪，黃恬，蒲泠伶，王雪穎，葉峻

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130）

趕黃草為虎耳草科扯根菜屬多年生草本植物，其所含黃酮類生物活性成分，可通過清除自由基，提高體內(nèi)活性酶水平，降低受肝損模型動物血清中轉(zhuǎn)氨酶水平等，具有治療黃疸、膽囊炎、肝損傷和傳染性肝炎等藥效作用[1-2]，并具有減肥、神經(jīng)保護、抗癌等生物功能[3-5]。同時，超聲波具有強烈的振動、空化效應(yīng)和攪拌作用，有利于提高提取效率，且方法簡單、提取物純度高，并可避免高溫對提取成分的影響[6-8]。本研究采用超聲輔助提取法優(yōu)化趕黃草花、葉、桿中黃酮類物質(zhì)的提取工藝，并比較趕黃草的花、葉、桿黃酮類物質(zhì)的含量及其對DPPH·和OH·自由基的清除率，為探究趕黃草的藥效作用及綜合開發(fā)提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外分光光度計（TU-1901，普析通用儀器公司），超聲儀（KQ-250DE，昆山超聲儀器公司）。

趕黃草花、葉、桿樣品（均從淘寶網(wǎng)購自四川古藺產(chǎn)。其中：花、葉各3 種，桿2 種），蘆?。藴势?，成都康邦生物科技有限公司；乙醇、AlNO3·9H2O、KOH、NaNO2（均為AR，成都科龍試劑有限責任公司）。

1.2 樣品預(yù)處理

將樣品置于80 ℃干燥箱中，烘4 h 后，粉碎，過80 目（180μm）篩，裝袋，密封備用。

1.3 樣品中總黃酮的測定

按NaNO2-Al(NO3)3-KOH 絡(luò)合物法，以蘆丁為標準品，將樣品提取液于512.3 nm 處測定吸光值。則：

式中：N—稀釋倍數(shù)；

C—總黃酮質(zhì)量濃度，mg·mL-1；

V—樣品液體積，mL；

m—樣品質(zhì)量，g。

1.4 樣品總黃酮提取物的抗氧化性測定

1.4.1 DPPH·自由基清除能力測定

參考田文翰[9]的實驗方法，將樣品總黃酮提取液稀釋至1.00 mg·mL-1，并各取2.0 mL 于20 mL 試管中，分別加入2.0 mL 0.2 mmol·L-1DPPH，混合均勻，置于暗處30 min 后，用95%乙醇做空白實驗，于517 nm 處測吸光度。則DPPH 自由基清除率為：

式中：Ai—樣品吸光度；

Ax—95%乙醇代替DPPH 測得吸光度；

Ao—空白吸光度。

1.4.2 OH·自由基清除能力測定

參考高亞妮[10]的實驗方法，將樣品總黃酮提取液稀釋至0.40 mg·mL-1，并各取1.0 mL 于20 mL 試管中，分別依次加入1.0 mL 9 mmol·mL-1FeSO4、1.0 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液和1.0 mL 8.8 mmol·L-1H2O2，用蒸餾水稀釋至10.0 mL，搖勻，置于37 ℃水浴鍋中，30 min 后于510 nm 處測定吸光度（Ai）；用蒸餾水代替H2O2，其余步驟不變，測定吸光度（Ax）；用蒸餾水做空白對照實驗，測定吸光度（Ao）。OH·清除率SR 計算同“1.4.1”。

2 結(jié)果分析

2.1 總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 料液比的影響

分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g，各4 份。參考孫宗良[1]用65% 乙醇為提取劑，固定：超聲溫度：45 ℃，超聲功率：100 W，超聲時間：45 min；設(shè)置料液比（g∶mL）1∶15，1∶20，1∶30，1∶40，提取樣品中的總黃酮，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對總黃酮得率的影響

由圖1 可見：以65% 乙醇為提取劑，花、葉、桿樣品分別在料液比為1∶20、1∶30、1∶30 時，總黃酮得率最大，分別為：9.4%、8.0%、3.2%。因此，花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳料液比(g∶mL)分別為：1∶20、1∶30、1∶30。

2.1.2 提取時間的影響

分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g，各4 份。固定超聲提取功率：100 W，超聲溫度：45 ℃，提取劑：65% 乙醇，料液比(g∶mL)：1∶30（其中：花樣品設(shè)為1∶20）。設(shè)置提取時間（min）：20、30、45、60，提取樣品中總黃酮，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對總黃酮得率的影響

由圖2 可見：在超聲功率：100 W，超聲溫度：45 ℃時，花、葉、桿樣品分別在超聲提取30、45、45 min 時，總黃酮得率最大，分別為：10.4%、8.0%、3.2%。因此，花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳時間依次為：30、45、45 min。

2.1.3 提取溫度的影響

分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g，各4 份。固定超聲提取功率：100 W，提取劑：65%乙醇，料液比(g∶mL)：1∶30（其中：花樣品設(shè)為1∶20），提取時間：45 min（其中：花樣品設(shè)為30 min）。設(shè)置提取溫度（℃）：20、35、45、55，提取樣品中總黃酮，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對總黃酮得率的影響

由圖3 可見：在超聲功率：100 W，提取時間：45 min（其中：樣品“花”為30 min）時，花、葉、桿樣品均在35 ℃時提取，總黃酮得率最大，分別為：11.2%、8.1%、3.4%。因此，花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳溫度均為：35 ℃。

2.1.4 超聲功率的影響

分別取預(yù)處理后的花、葉、桿樣品1.000 0 g，各4 份。提取溫度：35 ℃，提取劑：65% 乙醇，料液比(g∶mL)：1∶30（其中：樣品“花”設(shè)為1∶20），提取時間：45 min（其中：樣品“花”設(shè)為30 min）。設(shè)置超聲提取功率（W）：70、80、90、100、110，提取樣品中總黃酮，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對總黃酮得率的影響

由圖4 可見：在超聲功率：100 W，提取溫度：35 ℃，提取時間：45 min（其中：樣品“花”為30 min）時，花、葉、桿樣品在提取功率依次為100、80、90 W 時，總黃酮得率最大，分別為：11.2%、9.2%、4.0%。因此，花、葉、桿樣品總黃酮提取的最佳功率依次為100、80、90 W。

2.1.5 總黃酮提取工藝條件

綜合2.1.1-2.1.4，用65%乙醇為提取劑，超聲輔助法提取趕黃草花、葉、桿樣品中總黃酮的最佳工藝條件，見表1。

表1 樣品中總黃酮提取工藝條件

2.2 樣品測定與回收實驗

按表2 中各樣品超聲輔助提取最佳工藝條件，分別對趕黃草花、葉、桿中總黃酮進行提取，靜置，過濾，將濾液按“1.3”進行總黃酮含量測定及加標回收實驗，每個樣品均取3 份，平行測定3 次，取平均值。結(jié)果見表2。

表2 樣品測定與加標回收實驗結(jié)果

由表2 可見，所測趕黃草花、葉、桿樣品總黃酮得率依次別為：11.09%、9.27%、4.06%，呈現(xiàn)：花＞葉＞桿。所測樣品加標回收率均在90%～110%，RSD%≤0.91。表明：測定方法準確、可靠。

2.3 樣品黃酮提取物的抗氧化性測定

取樣品總黃酮提取液各3 份，分別按“1.4.1”、“1.4.2”進行DPPH·、OH·自由基清除率實驗，并用VC 做對照實驗，均平行測定3 次，取平均值。結(jié)果見表3。

表3 樣品提取液對DPPH·和OH·自由基清除率

由表3 可見，花、葉、桿總黃酮提取液對DPPH·和OH·自由基均有良好的清除能力。其中：花、葉、桿樣品總黃酮提取液對DPPH 清除率（%）平均值分別為：80.91、73.28、81.16，對OH·清除率（%）平均值分別為：74.48、66.41、80.92，二者均呈現(xiàn)出：桿＞花＞葉。

3 結(jié) 論

為探究趕黃草花、葉、桿的藥效作用，運用超聲輔助-分光光度法優(yōu)化了趕黃草花、葉、桿中總黃酮提取的料液比、超聲時間、超聲溫度及超聲功率等工藝條件及其總黃酮含量測定、并將樣品總黃酮提取物對DPPH、羥基自由基進行了清除率實驗。結(jié)果表明：

1）趕黃草花、葉、桿樣品中總黃酮平均得率依次別為：11.09%、9.27%、4.06%，呈現(xiàn)：花＞葉＞桿。所測樣品加標回收率均在90%～110%，RSD%≤0.91。表明：測定方法準確、可靠。

2）花、葉、桿樣品總黃酮提取液對DPPH·、OH·自由基具有良好的清除能力，均超過66%，且均呈現(xiàn)出：桿＞花＞葉。表明：趕黃草花、葉、桿均有很好的抗氧化性，具有良好的抗病毒、抗衰老等藥效作用。