羊毛醇中膽固醇提取工藝的研究

郭慶，趙露，李凱，徐賓朋，趙厚發(fā)

（安徽科寶生物工程有限公司，安徽 淮北 235000）

羊毛脂是由羊皮脂腺分泌的酯類物質(zhì)的多組分混合物, 主要是由脂肪酸與大致等量的脂肪醇、甾醇、三甲基甾醇等所形成的酯[1]。羊毛脂中含有10%～20%的膽固醇, 膽固醇是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組成部分，也是合成膽汁酸、VD3、甾醇類激素等物質(zhì)的前體，具有廣泛的市場(chǎng)需求，同時(shí)也是化妝品、液晶等的主要原料[2]。我國(guó)羊毛脂資源非常豐富，每年約有2～3 萬(wàn)t，但是利用率只有10%左右，其余被排放，造成巨大資源浪費(fèi)[3]。

羊毛脂中膽固醇提取的關(guān)鍵是先將羊毛醇與羊毛酸分離，再?gòu)难蛎贾刑崛∧懝檀肌难蛎贾刑崛∧懝檀挤椒ㄖ饕校悍肿诱麴s法、柱層析法、微生物發(fā)酵法、配合法和溶劑選擇結(jié)晶法等[4-6]。分子蒸餾法因?qū)υO(shè)備及操作條件有較高要求, 分出的膽固醇含量較低, 蒸餾殘?jiān)啵恢鶎游龇ㄒ蚬逃行再|(zhì)阻礙了大規(guī)模的應(yīng)用；微生物發(fā)酵法，菌株的篩選很困難，在工業(yè)上很難實(shí)施；配合法和溶解選擇結(jié)晶法的關(guān)鍵在于羊毛脂的皂化是否徹底。

本文以粗羊毛脂經(jīng)預(yù)處理[7]得到的羊毛醇為原料, 采用溶劑選擇結(jié)晶法，通過(guò)皂化、萃取、濃縮、結(jié)晶及重結(jié)晶等工序，優(yōu)化工藝條件，建立了膽固醇的產(chǎn)業(yè)化工藝路線。

1 材料與儀器

1.1 材料

羊毛脂，工業(yè)級(jí)，濟(jì)南某公司；無(wú)水乙醇，食品級(jí)，安徽安特食品股份有限公司；氫氧化鉀、環(huán)己烷、乙酸乙酯、硫酸，工業(yè)級(jí)，山東海化股份有限公司；膽固醇對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器

3 000 L 皂化釜、3 000 L 萃取釜、3 000 L 濃縮罐、2 000 L 結(jié)晶罐、2 000 L 重結(jié)晶罐、平板離心機(jī)-800，江蘇炬峰機(jī)械有限公司；PHS-3C pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TCS 電子臺(tái)秤，廈門佰倫斯電子科技有限公司；LC-2030 高效液相色譜儀，島津公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 皂化條件的優(yōu)化

稱取羊毛醇，加入氫氧化鉀溶液和乙醇，考察氫氧化鉀用量、乙醇用量及時(shí)間對(duì)膽固醇的收率和含量的影響。

2.2 萃取劑用量

向降至常溫的皂化液中加入環(huán)己烷，重復(fù)萃取2 次，檢測(cè)皂化液中是否還含有膽固醇。

2.3 結(jié)晶和重結(jié)晶

將萃取液濃縮至干，稱重，加乙酸乙酯和水，加熱回流時(shí)間1 h，降溫冷卻結(jié)晶，過(guò)濾，干燥得到粗品膽固醇；重結(jié)晶，稱重，加無(wú)水乙醇，調(diào)pH，加熱回流，降溫冷卻結(jié)晶，干燥得精品膽固醇。

2.4 含量指標(biāo)測(cè)定

稱取精品膽固醇，按照《中國(guó)藥典》[8]中規(guī)定的方法測(cè)定含量。HPLC 條件與方法：色譜柱規(guī)格為4.6 mm×250 mm，設(shè)定流速為1.0 mL·min-1，波長(zhǎng)為210 nm， 柱溫為30 ℃，計(jì)算方法為外標(biāo)法。

3 結(jié)果分析

3.1 皂化條件的優(yōu)化

羊毛醇皂化是否徹底是提取膽固醇的關(guān)鍵，優(yōu)化皂化工藝條件可提高膽固醇的收率，經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氫氧化鉀溶液用量（A）、乙醇用量（B）和皂化時(shí)間（C）是3 個(gè)比較重要的因素，選取了不同水平對(duì)同一批羊毛醇（膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.8%）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)取用100 kg 羊毛醇，結(jié)果如表1 所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

所得的皂化液經(jīng)相同的萃取、結(jié)晶和重結(jié)晶步驟得到精品膽固醇，對(duì)其中的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）用HPLC 分析，比較不同條件下的膽固醇的收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 皂化條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2 可以看出，根據(jù)極差的大小，可確定影響因素是C＞A＞B，即時(shí)間對(duì)膽固醇的收率影響最大，其次為氫氧化鉀溶液的用量，最后是乙醇的用量。皂化時(shí)間控制在4～9 h[9]，隨著皂化時(shí)間的延長(zhǎng)，膽固醇的收率也在增加，但增加到一定量時(shí)，膽固醇的收率趨于穩(wěn)定，其中的原因可能是羊毛醇與氫氧化鉀反應(yīng)需要的時(shí)間剛好，少于反應(yīng)時(shí)間，皂化不徹底，多于時(shí)間也不再進(jìn)行反應(yīng)。因此，通過(guò)各因素對(duì)膽固醇收率影響的綜合分析，得出的優(yōu)化條件為：氫氧化鉀溶液的用量為羊毛醇質(zhì)量的1 倍，乙醇用量為羊毛醇質(zhì)量的2 倍，皂化時(shí)間為7 h，即A2B2C3。

3.2 萃取劑用量的優(yōu)化

分別稱羊毛醇100 kg、乙醇200 kg、10%堿液100 kg，時(shí)間為7 h；降至常溫，分別加4 倍量、5 倍量和6 倍量環(huán)己烷，攪拌10 min，靜置50 min，重復(fù)萃取2 次；得濃縮物，加乙酸乙酯結(jié)晶，加無(wú)水乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到的膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到95%以上，再檢測(cè)比旋度、醇溶度、殘?jiān)戎饕笜?biāo)，所得結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同萃取劑添加量對(duì)膽固醇收率的影響

由表3 可以看出，隨萃取劑用量增加，膽固醇的收率也在增加，但增加到一定量時(shí)，膽固醇的收率增加不明顯，其中的原因是，添加5 倍量，重復(fù)萃取2 次，皂化液中的膽固醇已基本被全部萃取出來(lái)，當(dāng)繼續(xù)增加萃取劑量時(shí)，皂化液中微量的膽固醇不能被萃取劑萃取出來(lái)，從而使膽固醇的收率變化不大。

3.3 結(jié)晶和重結(jié)晶的優(yōu)化

3.3.1 結(jié)晶工藝的優(yōu)化

分別稱羊毛醇100 kg、乙醇200 kg、10%堿液100 kg，時(shí)間為7 h；降至常溫，加5 倍量環(huán)己烷，攪拌10 min，靜置50 min，重復(fù)萃取2 次；得到的濃縮物分別加6 倍量、8 倍量和10 倍量的乙酸乙酯和1 倍量的水調(diào)pH=4～5，加熱回流1 h，降溫冷卻結(jié)晶，離心機(jī)離心得膽固醇，干燥；用乙醇重結(jié)晶，離心干燥得的膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到95%以上，結(jié)果如表4 所示。

表4 不同乙酸乙酯添加量對(duì)膽固醇收率的影響

由表4 可以看出，隨著乙酸乙酯的用量增加，膽固醇的收率也在增加，但增加到一定量時(shí)，膽固醇的收率反而下降[10]，其中的原因是，添加8 倍量的乙酸乙酯時(shí)，濃縮物中的膽固醇全部溶解在試劑中，通過(guò)調(diào)整水層的pH，其中雜質(zhì)進(jìn)入到水中被去除掉；加6 倍量時(shí)，溶解完后，過(guò)濾時(shí)堵過(guò)濾器，說(shuō)明加熱的回流的條件下膽固醇可以溶解在乙酸乙酯中，但稍微降溫，就出現(xiàn)膽固醇過(guò)飽和，結(jié)晶析出，影響收率；加10 倍量時(shí)，通過(guò)調(diào)整水層的pH，其中的雜質(zhì)進(jìn)入水中被去除掉，因乙酸乙酯過(guò)量，過(guò)濾后，母液中帶有膽固醇，從而影響膽固醇的收率。

3.3.2 重結(jié)晶工藝的優(yōu)化

分別稱羊毛醇100 kg、乙醇200 kg、10%堿液100 kg，時(shí)間為7 h；降至常溫，加5 倍量環(huán)己烷，攪拌10 min，靜置50 min，重復(fù)萃取2 次；得到的濃縮物分別加 8 倍量的乙酸乙酯和1 倍量的水調(diào)pH=4～5，加熱回流1 h，降溫冷卻結(jié)晶，離心機(jī)離心得膽固醇，干燥；分別加6 倍量、8 倍量和10 倍量的乙醇，調(diào)pH=10.5～11.0，加熱回流1 h 進(jìn)行重結(jié)晶，過(guò)濾，降溫冷卻結(jié)晶，離心干燥得到的膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到95%以上，所得結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同無(wú)水乙醇添加量對(duì)膽固醇收率的影響

由表5 可以看出，隨著乙醇的用量增加，膽固醇的收率也增加，但增加到一定量時(shí)，膽固醇的收率反而下降[11]，其中的原因是，添加8 倍量的乙醇時(shí)，膽固醇全部溶解在試劑中；加6 倍量時(shí)，溶解完后，過(guò)濾時(shí)堵過(guò)濾器，說(shuō)明加熱回流的條件下膽固醇可以溶解在乙醇中，但稍微降溫，就出現(xiàn)膽固醇過(guò)飽和，結(jié)晶析出，影響收率；加10 倍量時(shí)，因乙醇過(guò)量，過(guò)濾后，母液中帶有膽固醇，從而影響膽固醇的收率。

4 結(jié) 論

羊毛脂經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，羊毛醇中含有25.8%膽固醇，采用皂化、萃取、濃縮結(jié)晶及重結(jié)晶等工藝步驟建立了膽固醇的產(chǎn)業(yè)化工藝路線，以膽固醇收率為指標(biāo)確定的優(yōu)化工藝如下：乙醇用量為2 倍量，10%堿液用量1 倍量，時(shí)間為6 h；加環(huán)己烷為皂化液總質(zhì)量的5 倍，時(shí)間為60 min，重復(fù)萃取2 次；用乙酸乙酯為結(jié)晶試劑，其用量為8 倍量，加熱回流時(shí)間1 h；用無(wú)水乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，用量為膽固醇質(zhì)量的8 倍量，pH=10.5，回流時(shí)間2 h，結(jié)晶溫度為5～10 ℃，所得膽固醇產(chǎn)品的收率≥90%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，熔點(diǎn)≥147 ℃。