不同癥狀類型苜蓿病毒病AMV 病原檢測(cè)及其寄主范圍測(cè)定

周建玲，梁巧蘭，魏列新，周其宇，田龍，陳應(yīng)娥，王存穎，張國(guó)印

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

苜蓿屬（Medicago）植物通稱苜蓿（Medicago sativa），豆科（Leguminosae）多年生開花草本植物，含有豐富維生素K、維生素C、維生素B 和粗蛋白，動(dòng)物喜愛食用，是我國(guó)種植面積最大的牧草，但是我國(guó)仍是世界上最大的苜蓿進(jìn)口國(guó)，國(guó)內(nèi)的苜蓿生產(chǎn)供不應(yīng)求［1］，并且隨著“振興奶業(yè)苜蓿行動(dòng)”“糧改飼”政策的持續(xù)推進(jìn)［2］，苜蓿的種植面積不斷增加，隨著種植年限的延長(zhǎng)，導(dǎo)致苜蓿病毒病的發(fā)生和傳播媒介的活動(dòng)頻率也隨之提高 ，使得苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)降低［3］。據(jù)報(bào)道，侵染苜蓿的病毒病原有50 多種，苜蓿花葉病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）和紫花苜蓿甲型雙分病毒2（M. sativaalphapartitivirus 2， MsAPV 2）為主要病毒病原，發(fā)病率分別為91.7%和74.4%以上［4-5］；郭志鵬等［6］對(duì)河南田間紫花苜蓿的30 個(gè)品種進(jìn)行了抗性研究，發(fā)現(xiàn)這30 個(gè)品種均受AMV 侵染，田間發(fā)病率均超過了94%，病情指數(shù)為31.56～55.50。甘肅省作為全國(guó)苜蓿種植面積最大的省份，苜蓿病毒病發(fā)生普遍，平均發(fā)病率和病情指數(shù)為32.15% 和16.27，蘭州市安寧區(qū)、景泰縣田間苜蓿均受到AMV 侵染，檢出率為100%［7］，對(duì)苜蓿造成嚴(yán)重危害，可使苜蓿干重降低37.0%～66.0%、花粉萌發(fā)率降低21.5%、苜蓿根瘤數(shù)減少31.0%～67.0%［8］；同時(shí)，AMV 傳播方式多樣，侵染能力強(qiáng)，寄主范圍十分廣泛，除了侵染豆科牧草外還可侵染茄科（Solanaceae）、菊科（Asteraceae）、藜科（Chenopodiaceae）等多種經(jīng)濟(jì)作物［9-10］。

病毒侵染寄主植物后，常常會(huì)與寄主植物發(fā)生一系列相互作用，從而導(dǎo)致寄主植物表現(xiàn)出多種不同類型的癥狀，引起這些癥狀的原因主要是植物病毒與寄主因子相互作用［11-12］。據(jù)報(bào)道，AMV 侵染苜蓿可使其葉綠素含量顯著降低［13］；感染馬鈴薯Y 病毒脈壞株系（potato virus Y， PVYN）后，煙草（Nicotiana tabacum）葉綠素含量明顯降低。郭興啟等［14-15］認(rèn)為病毒侵染后植物體內(nèi)葉綠素含量明顯下降的原因主要有兩種：一種認(rèn)為病毒侵染激活了葉綠素分解酶而使葉綠素分解，另一種認(rèn)為葉綠體脂質(zhì)過氧化與葉綠素的分解存在偶聯(lián)機(jī)制，病毒的侵染造成組織壞死進(jìn)而影響葉綠體的生物合成；有研究發(fā)現(xiàn)病毒侵染可導(dǎo)致葉綠體發(fā)育畸形、數(shù)量減少、基粒和類囊體結(jié)構(gòu)變化，黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV）侵染寄主后會(huì)進(jìn)入葉綠體，導(dǎo)致其畸形發(fā)育，使其葉綠素含量降低，出現(xiàn)黃化、褪綠、花葉、畸形、矮化等癥狀［16-17］；同時(shí)，病毒侵染寄主后在寄主體內(nèi)的積累量與癥狀產(chǎn)生也密切相關(guān)，張威等［18］的研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯A 病毒（potato virus A， PVA）在植物中含量越高，癥狀表現(xiàn)越明顯，主要表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)葉緣皺縮、輕花葉，還能導(dǎo)致馬鈴薯（Solanum tuberosum）塊莖嚴(yán)重裂口、芽眼變深。

而有關(guān)田間癥狀表現(xiàn)不同的苜蓿病毒病是否由AMV 侵染引起、不同癥狀類型的苜蓿病樣中AMV 濃度、葉綠素含量與癥狀表現(xiàn)的關(guān)系，以及AMV 對(duì)不同寄主的致病性等問題未見系統(tǒng)研究報(bào)道。為此，本研究通過對(duì)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)田中病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，對(duì)以往沒有研究過的癥狀類型進(jìn)行歸類，測(cè)定各種癥狀類型病樣葉片中葉綠素含量，檢測(cè)AMV 的有無(wú)，分析葉綠素含量和病毒含量與癥狀表現(xiàn)之間的相關(guān)性，并對(duì)來(lái)自不同癥狀表現(xiàn)的AMV 進(jìn)行提純，測(cè)定其對(duì)不同寄主的致病性。研究結(jié)果對(duì)探明苜蓿病毒病癥狀表現(xiàn)與寄主和病毒之間的關(guān)系，明確AMV 的寄主范圍，指導(dǎo)苜蓿病毒病的有效防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試試劑 苜蓿花葉病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（double antibody sandwich enzyme-linked immune sorbent assay，DAS-ELISA）檢測(cè)試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）、吐溫-20（Tween-20）、0.02 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）、丙酮、乙醇、0.01 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉、2% TritonX-1000、1%巰基乙醇、0.01 mol·L-1MgSO4、磷酸鉀緩沖液（pH 7.5，0.5 mol·L-1）、氯仿、正丁醇、6%的聚乙二烯吡絡(luò)烷酮 6000、NaCl、0.01 mol·L-1MgSO4磷酸緩沖液。

1.1.2 供試寄主 禾本科（Poaceae）：大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticeae aestivum）、玉米（Zea mays）、燕麥（Avena sativa）；茄科（Solanaceae）：本氏煙（Nicotiana benthamiana）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）、普通煙等9科32 種植物種子均購(gòu)于蘭州市種子市場(chǎng)。

1.1.3 試驗(yàn)儀器及設(shè)備 酶聯(lián)免疫測(cè)定儀（ELX800，美國(guó)Bio-Tek 公司）、人工氣候箱（QRGN-400-3，杭州琦勝電子科技有限公司）、高壓滅菌鍋（LDZF-75L-Ⅱ，上海申安醫(yī)療器械廠）、低溫冷凍離心機(jī)（LX-165T2R，德國(guó)Eppendorf 公司），勻漿機(jī)（FS-1，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司），磁力攪拌器（HHS1，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間調(diào)查及癥狀類型歸類 于2022 年5-6 月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田以及蘭州北濱河路綠化帶苜蓿種植區(qū)，調(diào)查具有典型病毒病癥狀的病株，按照癥狀類型進(jìn)行歸類后，使用消毒剪刀采集病株及健康植株若干，做好標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室，每種癥狀選取長(zhǎng)勢(shì)一致的病株各5 株，根據(jù)葉片有無(wú)花葉、畸形，病株是否矮化等表現(xiàn)，進(jìn)行進(jìn)一步歸類，統(tǒng)計(jì)每種癥狀類型病葉所占比例；并將同一癥狀類型的病葉用自來(lái)水沖洗干凈，放在濕紗布上晾干水分后，去葉脈后每100 g 為1 份，分別裝入一次性封口袋中，做好標(biāo)記后，每個(gè)癥狀類型共采集3 份，置于-80 ℃冰箱保存，用于病毒提純［19］；另外稱取每種癥狀類型病葉和健康葉片各0.20 和1.00 g 分別用于葉綠素含量測(cè)定和AMV 檢測(cè)，每種癥狀類型為一個(gè)處理，重復(fù)3 次；備用。

1.2.2 葉綠素含量測(cè)定 采用丙酮乙醇混合法［20］測(cè)定苜蓿葉片的葉綠素含量，步驟如下：將無(wú)水丙酮和無(wú)水乙醇等體積混合后，取1.2.1 中保存的不同癥狀類型的苜蓿病樣和健康苜蓿各0.2 g，剪碎混勻后分別裝入具塞試管中，并加入10 mL 丙酮乙醇混合液塞緊塞子，置于黑暗條件下24 h，直至試管中苜蓿葉片完全無(wú)綠色后，分別加入酶標(biāo)板中，以健康苜蓿葉片為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，測(cè)定各樣品提取液在波長(zhǎng)663、645、470 nm 處的吸光值，將測(cè)得的吸光值代入下式計(jì)算葉綠素含量。

式中：V為提取液總體積（mL）；FW為樣品鮮重（g）；A663、A645和A470為吸光值；Ca和Cb分別為葉綠素a 和葉綠素b的含量。

1.2.3 不同癥狀類型的苜蓿病毒病病樣AMV 病原檢測(cè) 取1.2.1 中保存的不同癥狀類型的苜蓿病樣和健康苜蓿各1 g，加入4 mL 配好的PBS 和適量的石英砂充分研磨后于4 ℃ 2000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液即為樣品液，根據(jù)AMV DAS-ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書，取保存于-80 ℃的提純AMV，設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、樣品孔，重復(fù)3 次。取出酶標(biāo)板，放置于室溫下30 min，按照DAS-ELISA 試劑盒操作步驟，分別先后加入陰、陽(yáng)性對(duì)照、樣品液和酶液，溫浴、洗滌、拍干。最后加入顯色液和終止液。測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)的OD 值，根據(jù)OD 值與臨界值（陰性對(duì)照OD 平均值+0.15）的關(guān)系，判斷不同癥狀類型病樣中AMV 是否為陽(yáng)性。

代入Y=226.63X-10.16［19］計(jì)算出樣品中AMV 濃度，其中X 為不同病樣450 nm 處所對(duì)應(yīng)的吸光度值。每種癥狀類型病樣為一個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次。并按下式計(jì)算各樣品病毒的檢出率。

1.2.4 AMV 提純 參考陳永萱［21］、金磊磊［22］的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。取保存于-80 ℃冰箱中不同癥狀類型的苜蓿病樣各100 g，加入預(yù)冷的含0.01 mol·L-1EDTA、2% TritonX-1000、1%巰基乙醇的磷酸鉀緩沖液（pH 7.5，0.5 mol·L-1）200 mL，用勻漿機(jī)勻漿至黏液狀，然后加入1∶1 混勻的氯仿和正丁醇10～20 mL 繼續(xù)勻漿1～2min，將混合液在4 ℃ 8000 r·min-1下離心20 min，棄沉淀取上清液，在上清液中加入6%的聚乙二烯吡絡(luò)烷酮6000，再加入NaCl 使上清液鹽濃度為0.1 mol·L-1，然后放在磁力攪拌器上攪拌4 h 后，將混合液4 ℃ 8000 r·min-1離心20 min，棄上清液，將沉淀充分溶解于0.01 mol·L-1EDTA、1% TritonX-100 的磷酸鉀緩沖液（pH 7.4，0.02 mol·L-1），合并后4 ℃ 4000 r·min-1離心120 min，棄上清液，將沉淀充分懸浮于含0.01 mol·L-1MgSO4磷酸緩沖液中（pH 7.4，0.02 mol·L-1），4 ℃ 12000 r·min-1離心20 min，棄上清液，沉淀用0.02 mol·L-1，pH 為7.0 磷酸緩沖液充分懸浮，后檢測(cè)AMV 濃度（同1.2.3），用2 mL 離心管分裝，保存在-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.5 提純AMV 對(duì)不同寄主致病性測(cè)定 選取籽粒飽滿、大小一致的寄主植物種子放入鋪有海綿和濾紙的滅菌培養(yǎng)皿，每皿加入20 mL 滅菌水，蓋上蓋子后將其放置于25 ℃恒溫箱中催芽，待種子發(fā)芽后，種植于裝有滅菌土的塑料花盆中（13 cm×15 cm），每盆種植一株，每種寄主種植160 株，做好標(biāo)記，罩上防蟲網(wǎng)，放置于溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，光照強(qiáng)度8000 Lux、光暗交替16 h/8 h（光照/黑暗）的智能人工氣候箱中培養(yǎng)，定期澆水管理，培養(yǎng)至4～5 葉期，備用。

根據(jù)1.2.1 中不同苜蓿病株癥狀類型調(diào)查結(jié)果，采用摩擦接種法［23］，用不同癥狀類型提純的AMV 接種不同寄主，具體方法為：將保存于-80 ℃冰箱中的4 種AMV 提純病毒液取出，放至提前準(zhǔn)備好的冰上，待其溶解至室溫，用0.02 mol·L-1PBS（pH 7.0）將其稀釋為60 pg·mL-1的病毒液，備用；選取長(zhǎng)勢(shì)一致的供試寄主，用滅菌水沖洗接種葉，待葉片干凈后，將其置于黑暗條件下24 h 后取出，一只手從葉片下面托住，在葉片上撒上少量金剛砂，取上述稀釋好的各病毒液20 μL 滴于靠近葉柄的葉面上，另一只手輕輕用手指將提純病毒由葉柄至葉尖單向摩擦1 次，以20 μL 0.02 mol·L-1PBS（pH 7.0）代替病毒接種為對(duì)照，接種完成后用洗瓶沖洗葉片，洗去多余的金剛砂和病毒液，每種癥狀類型的提純AMV 分別接種10 株，重復(fù)3 次，放置于溫度25 ℃、光照8000 Lux、光暗交替16 h/8 h（光照/黑暗）的智能人工氣候箱中，定期澆水管理，于接種后第30 天，根據(jù)下列分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查各處理寄主的發(fā)病情況，每個(gè)處理調(diào)查50 片葉，重復(fù)3 次，按下列公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

式中：Di為病情指數(shù)；Ni為各級(jí)病葉數(shù)；Gi為各級(jí)病害代表值；NT為調(diào)查總?cè)~數(shù)。

同時(shí)采集各處理的寄主心葉各1 g，以健康植株為對(duì)照，制備樣品液，采用DAS-ELISA 法檢測(cè)AMV 侵染情況，并計(jì)算AMV 濃度（同1.2.3），每個(gè)處理重復(fù)3 次。

發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)：寄主植物無(wú)癥狀；1 級(jí)：葉片微皺或輕微花葉，病株不矮化；2 級(jí)：葉片畸形、皺縮或輕度花葉，病株無(wú)明顯矮化；3 級(jí)：葉片變小，花葉且皺縮，病株矮化為正常植株的1/5 以上；4 級(jí)：葉片明顯變小，中度花葉、皺縮、出現(xiàn)壞死病斑，病株矮化為正常植株的2/5 以上；5 級(jí)：重度花葉、明顯病斑及壞死，病株矮化為正常植株的3/5 以上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Power Point 2019 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿病毒病癥狀類型

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田及蘭州北濱河路綠化帶苜蓿種植區(qū)，苜蓿病毒病有4 種新的癥狀類型（圖1）。輕花葉型：葉片顏色黃化褪綠，葉片輕微皺縮，葉緣向下（圖1A）；重花葉型：葉片沿著側(cè)脈出現(xiàn)黃、綠相間的斑駁，病面平展（圖1B）；葉片邊緣褪綠黃化型：葉片邊緣褪綠黃化且向上翻卷，主脈深綠色，植株稍矮化（圖1C）；葉片畸形皺縮花葉矮化型：葉面扭曲皺縮，葉尖變鈍，并伴有多個(gè)小的黃化斑，且病株嚴(yán)重矮化（圖1D）；其中病葉率由大到小依次是葉片畸形皺縮花葉矮化型＞重花葉型＞葉片邊緣褪綠黃化型＞輕花葉型，分別占病葉總數(shù)的42.52%、24.41%、21.26%和11.81%。

圖1 苜蓿花葉病田間4 種癥狀類型Fig.1 Four symptom types of alfalfa mosaic disease in the field

2.2 苜蓿病毒病癥狀表現(xiàn)和葉綠素含量之間的相關(guān)性

通過測(cè)定4 種癥狀類型的病樣中葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，各癥狀類型的病葉中葉綠素含量、類胡蘿卜素含量均發(fā)生了明顯變化，葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量均顯著低于對(duì)照，類胡蘿卜素含量均顯著高于對(duì)照；其中輕花葉型的葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量最高，與對(duì)照相比分別降低了20.67%、60.29%和39.16%，類胡蘿卜素含量在4 種病樣中最低，與對(duì)照相比提高36.23%；葉片畸形皺縮花葉矮化型的葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量最低，與對(duì)照相比分別降低了58.00%、76.47%和66.43%，類胡蘿卜素含量最高，比對(duì)照相比提高了134.06%，其他兩種癥狀類型病葉的葉綠素a、b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量介于二者之間，且差異顯著（P＜0.05）（表1）。

表1 不同癥狀類型苜蓿病樣中病葉率及葉綠素含量Table 1 The rate of diseased leaves and chlorophyll content in alfalfa disease-like with different symptom types

2.3 不同癥狀類型的苜蓿病毒病病樣AMV 病原檢測(cè)及其提純

通過對(duì)4 種癥狀類型20 份苜蓿病毒病病樣進(jìn)行DAS-ELISA 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輕花葉型、重花葉型、葉片邊緣褪綠黃化型和葉片畸形皺縮花葉矮化型病樣中均檢測(cè)出AMV，病毒檢出率均為100%，且純化后4 種類型中AMV 濃度均提高，其中葉片畸形皺縮花葉矮化型病樣中AMV 濃度在純化前后均最高，分別為252.96 和343.43 pg·mL-1，輕花葉型病樣中AMV 濃度在純化前后均最低，分別為102.27 和206.18 pg·mL-1，其他2 種癥狀類型介于二者之間（表2）。

表2 不同癥狀類型苜蓿病樣AMV 提純前后DAS-ELISA 檢測(cè)Table 2 DAS-ELISA detection of AMV of alfalfa disease-like with different symptom types before and after purification

2.4 不同癥狀表現(xiàn)病樣中提純的AMV 對(duì)不同寄主致病性測(cè)定及癥狀表現(xiàn)

2.4.1 不同癥狀表現(xiàn)病樣中提純的AMV 對(duì)不同寄主致病性測(cè)定 將4 種癥狀類型病樣提取的AMV，分別接種至9 科32 種供試植物上，從發(fā)病情況觀察發(fā)現(xiàn)來(lái)源于4 種癥狀類型病樣中的AMV 均可侵染昆諾藜（Chenopodium quinoa）、莧色藜（Chenopodium amaranticolor）、心葉煙、普通煙、番茄（Lycopersicon esculentum）、辣椒（Capsicum annuum）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、豇豆（Vigna unguiculata）、豌豆（Pisum sativum）、地三葉（Trifolium subterraneum）、向日葵（Helianthus annuus）、千日紅（Gomphrena globosa）和雞冠花（Celosia cristata）等7 科27 種植物，發(fā)病率均為100%，禾本科寄主中大麥發(fā)病最嚴(yán)重，病情指數(shù)為24.17，茄科寄主中馬鈴薯發(fā)病最嚴(yán)重，病情指數(shù)為39.44，豆科寄主中蠶豆（Vicia faba）發(fā)病最嚴(yán)重，病情指數(shù)為39.21，葫蘆科（Cucurbitaceae）寄主中發(fā)病最嚴(yán)重的為西葫蘆（Cucurbita pepo），病情指數(shù)為42.11，菊科寄主中發(fā)病最嚴(yán)重的是翅果菊（Pterocypsela indica），病情指數(shù)為37.71，莧科（Amaranthaceae）寄主中發(fā)病最嚴(yán)重的為千日紅，病情指數(shù)為39.71，藜科寄主中發(fā)病最嚴(yán)重的是昆諾藜，病情指數(shù)為31.46。不同科寄主植物中發(fā)病最嚴(yán)重的是葫蘆科植物，其平均病情指數(shù)為40.06，病毒含量為213.07 pg·mL-1，發(fā)病最輕的是禾本科寄主，其平均病情指數(shù)為20.56，病毒含量為163.78 pg·mL-1，其他科寄主介于兩者之間（表3）。

2.4.2 不同癥狀表現(xiàn)病樣中提純的AMV 對(duì)不同寄主的侵染致病癥狀表現(xiàn) 4 種病樣提純的AMV 對(duì)同一寄主的致病癥狀表現(xiàn)一致，且經(jīng)DAS-ELISA 檢測(cè)均為陽(yáng)性；6 科23 種寄主植物被接種AMV 后表現(xiàn)出明顯的癥狀（圖2）；茄科植物中，本氏煙葉片出現(xiàn)花葉皺縮，侵染后期上部葉片變小，心葉煙葉片前期有蝕紋現(xiàn)象，后期葉片出現(xiàn)白斑枯萎并伴有葉片皺縮，普通煙葉片出現(xiàn)鮮黃色不規(guī)則病斑，辣椒、番茄葉片有局部枯斑，新葉嚴(yán)重畸形皺縮，茄子葉片皺縮畸形并伴有白色枯斑，馬鈴薯葉片向下卷曲并出現(xiàn)紅褐色病斑；豆科植物中，菜豆和豇豆葉片出現(xiàn)紅褐色病斑，豌豆沒有系統(tǒng)癥狀但托葉出現(xiàn)萎蔫的癥狀，蠶豆葉片皺縮畸形，葉緣向下卷曲，地三葉葉片沿葉脈有褪綠黃化現(xiàn)象，苜蓿葉片出現(xiàn)了典型的花葉皺縮現(xiàn)象；葫蘆科植物中，黃瓜、西葫蘆癥狀表現(xiàn)為褪綠白色病斑，其中西葫蘆在9 科32 種供試植物中發(fā)病最嚴(yán)重，其病情指數(shù)為42.11，病毒濃度為316.19 pg·mL-1（表3）；菊科植物中，萵苣（Lactuca sativa）和向日葵葉片出現(xiàn)壞死枯斑，翅果菊葉片出現(xiàn)紅褐色病斑；藜科植物中，昆諾藜、莧色藜和灰綠藜都表現(xiàn)出系統(tǒng)花葉和不同程度的壞死、畸形癥狀。禾本科4 種寄主在被侵染后僅表現(xiàn)出輕微的矮化現(xiàn)象，但DAS-ELISA 檢測(cè)也均為陽(yáng)性。龍葵（Solanum nigrum）、菊芋（Helianthus tuberosus）、上海青（Brassicachinensis）、大白菜（Brassica pekinensis）和鵝絨藤（Cynanchum chinense）5 種植物在接種AMV 后沒有出現(xiàn)癥狀，DAS-ELISA 檢測(cè)為陰性（圖2）。

圖2 AMV 侵染不同寄主的癥狀表現(xiàn)Fig.2 Symptoms of AMV infecting different hosts

3 討論與結(jié)論

3.1 苜蓿病毒病癥狀表現(xiàn)與葉綠素、病毒含量的相關(guān)性

苜蓿作為AMV 的天然宿主，受AMV 侵染后表現(xiàn)為花葉、皺縮、矮化、卷曲等典型癥狀［24］。經(jīng)田間調(diào)查及室內(nèi)病原種類鑒定發(fā)現(xiàn)，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)田新發(fā)現(xiàn)的4 種癥狀類型的苜蓿病毒病病樣均有AMV，分別是輕花葉、重花葉、葉片邊緣褪綠黃化型、葉片畸形皺縮花葉矮化型。葉綠體是病毒侵染寄主后癥狀表現(xiàn)的重要靶標(biāo)［25-26］，植物病毒在侵染寄主植物后其葉綠體受破壞程度、病毒含量與癥狀表現(xiàn)有一定關(guān)系，紫花苜蓿感染AMV 后，表現(xiàn)為植株矮化，葉或葉柄扭曲變形，葉片黃化斑駁皺縮等癥狀，其葉綠素含量、凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度較健康植株分別降低了35.16%、93.30%、65.40%和40.00%［27］；馬鈴薯X 病毒外殼蛋白（potato virus X coat protein，PVX-CP）和病毒顆粒，可以使寄主植物的葉綠體膜和類囊體片層的結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致葉片黃化［28］。

此外，病毒侵染后，寄主植物體內(nèi)病毒含量與癥狀也密切相關(guān)。煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus， TMV）在侵染寄主后，植物葉綠體中的病毒粒子積累量與花葉癥狀呈正相關(guān)［29］，馬鈴薯A 病毒的3 種分離物在馬鈴薯上也表現(xiàn)出植株體內(nèi)病毒含量越高，馬鈴薯癥狀越嚴(yán)重，可導(dǎo)致馬鈴薯塊莖嚴(yán)重裂口、芽眼變深的嚴(yán)重癥狀［18］；番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus， TSWV）侵染寄主植物后表現(xiàn)為典型癥狀的葉部組織細(xì)胞中，病毒粒體呈簇狀聚集于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，葉綠體基粒片層降解，線粒體增多［30-31］；萵苣感染TSWV 后，病毒粒體相對(duì)含量、亞細(xì)胞病變程度與植株癥狀嚴(yán)重度呈正相關(guān)，在侵染后期自噬體囊泡明顯增多［32］，由此可見，寄主植物葉綠體破壞越嚴(yán)重，寄主體內(nèi)病毒的積累量越多，寄主植物的癥狀表現(xiàn)越嚴(yán)重。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AMV 侵染苜蓿后引起的癥狀表現(xiàn)與葉綠素含量、AMV 含量之間呈正相關(guān)，癥狀表現(xiàn)最嚴(yán)重的葉片畸形皺縮花葉矮化型病樣的葉綠素a、b、總?cè)~綠素含量均比對(duì)照低58.00%以上，類胡蘿卜素含量相比于對(duì)照高134.06%，且AMV 含量最高，為252.96 pg·mL-1。另外，據(jù)報(bào)道在癥狀表現(xiàn)為花葉、黃斑花葉的苜蓿病樣中除了檢測(cè)到AMV 之外還檢測(cè)到了白三葉草花葉病毒（white clover mosaic virus， WCMV）、菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus， BYMV）和豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus， CPMV），而在皺縮病樣中檢測(cè)到了AMV 和BYMV，在黃斑花葉中檢測(cè)到了AMV、BYMV 和CPMV 3 種病毒［7］；同時(shí)，在葉片表現(xiàn)為斑駁、黃化、皺縮等的苜蓿病樣中檢測(cè)出了AMV、紫花苜蓿甲型雙分病毒1（M. sativaalphapartitivirus 1， MsAPV1）、紫花苜蓿丁型雙分病毒1（M. sativadeltapartitivirus 1， MsDPV1）［33］；在癥狀表現(xiàn)為斑駁花葉、黃化、花葉皺縮等的苜蓿病樣中首次檢測(cè)到了AMV 和苜蓿卷葉病毒（alfalfa leaf curl virus， ALCV）［34］；而本研究?jī)H測(cè)定和檢測(cè)了4 種癥狀類型的苜蓿病樣中葉綠素含量和AMV 濃度，而對(duì)不同癥狀類型病樣中是否存在其他病毒與AMV 發(fā)生復(fù)合侵染加重或使癥狀表現(xiàn)不同的問題尚未涉及，還需進(jìn)一步探究。

另外，AMV 作為典型的正義單鏈RNA 病毒，變異率很高，適應(yīng)性很強(qiáng)，其外殼蛋白（coat protein， CP）基因序列差異可能導(dǎo)致在同一寄主上的癥狀差異，Xu 等［35］設(shè)計(jì)了能擴(kuò)增CP 全序列的引物，克隆測(cè)序得到了AMV 分離物的CP 序列信息，發(fā)現(xiàn)侵染加拿大馬鈴薯的AMV 分離株與之前報(bào)道的馬鈴薯上的AMV 引起的癥狀不一致，不會(huì)引起馬鈴薯塊莖的壞死。而本研究中4 種癥狀類型的苜蓿病樣中導(dǎo)致癥狀差異的原因是否與AMV 基因變異有關(guān)等問題還有待進(jìn)一步研究。

3.2 AMV 對(duì)不同寄主的致病性測(cè)定

AMV 寄主范圍廣泛，可侵染70 多科的700 余種植物［34］，不僅可以侵染多種豆科牧草，如草木樨屬（Melilotus）、三葉草屬（Trifolium）、羽扇豆屬（Lupinus）以及其他具有食用價(jià)值的豆科植物，如豌豆、蠶豆、綠豆（Vigna radiata）、赤豆（Vigna angularis）等，茄科植物也是它主要侵染的對(duì)象，如本氏煙、心葉煙、番茄、辣椒、馬鈴薯等［33］，對(duì)于不同植物，其引起的癥狀表現(xiàn)各不相同，葫蘆科和茄科植物感染AMV 后，可產(chǎn)生花葉、黃化、褪綠、卷葉癥狀［36-37］，豆科植物感染AMV 后，可引起花葉、畸形、壞死癥狀［38-39］。本試驗(yàn)通過摩擦接種的方法將來(lái)自4 種不同癥狀類型的AMV 分別接種到9 科32 種植物上，通過癥狀觀察及DAS-ELISA 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大麥、小麥、本氏煙、西葫蘆等7 科27 種植物具有侵染性，可引起系統(tǒng)花葉、葉片畸形等典型癥狀，其中茄科植物癥狀表現(xiàn)為系統(tǒng)花葉及葉片畸形皺縮；豆科植物癥狀表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)紅褐色病斑、花葉及葉片畸形；菊科、莧科、葫蘆科、藜科植物除了花葉之外，還出現(xiàn)局部枯斑、葉片皺縮畸形等癥狀，其中西葫蘆癥狀表現(xiàn)最嚴(yán)重，為褪綠白色病斑，病情指數(shù)為42.11，AMV 含量為316.19 pg·mL-1；禾本科4 種寄主植物僅表現(xiàn)出輕微矮化，但DAS-ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)為陽(yáng)性。

本研究將4 種癥狀類型病樣分別提純的AMV 摩擦接種寄主植物后，4 個(gè)來(lái)源的提純AMV 對(duì)同一種寄主的致病癥狀均一致，初步確定了這4 種癥狀類型的苜蓿病樣中所含有的AMV 為同一種株型，但其是否存在差異還需進(jìn)行分子檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步確定；另外，AMV 還可侵染田旋花（Convolvulus arvensis）、三葉草（Trifolium）、四川錦葵（Malva parviflora）、菊苣（Cichorium intybus）、薄荷（Mentha haplocalyx）、絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）等雜草和藥材植物［40-43］，從而擴(kuò)大病毒存在的范圍，導(dǎo)致其在經(jīng)濟(jì)作物上進(jìn)一步傳播危害，而本研究?jī)H對(duì)AMV對(duì)部分重要的經(jīng)濟(jì)作物和雜草做了致病性檢測(cè)，而對(duì)大部分田間常見雜草和中藥材植物的致病性以及對(duì)豆科牧草受AMV 侵染后根瘤數(shù)量、花粉數(shù)和蛋白含量的影響等問題尚未涉及，還有待進(jìn)一步研究。