植物端粒DNA 結合蛋白及端粒酶活性調控研究

孫守江，馬馼，毛培勝，豆麗茹，賈志程，孫銘，王娟

（中國農業大學草業科學與技術學院，北京 100193）

端粒是一種特殊的核蛋白復合物，其功能在于保護真核生物染色體末端的完整性和穩定性［1］。端粒結構缺失會導致染色體的核溶解和端粒的融合，最終導致細胞死亡［2］。在細胞連續幾輪分裂過程中，端粒DNA 逐漸損失，由于細胞在分裂中面臨DNA 末端復制問題，端粒是一種解決染色體DNA 序列缺失的特殊結構［3］。

端粒酶是真核生物細胞中的一種特殊酶，不同于常見的生理生化反應速率的調控酶，端粒酶是一種核糖核蛋白酶，主要由端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和端粒酶RNA（telomerase RNA，TER）兩個亞單位組成［4］。端粒酶作為一種特殊的端粒相關蛋白，在端粒長度維持以及端粒損傷修復中扮演著重要的角色［5-6］。因此，研究植物在生長發育過程中端粒酶活性的變化規律有助于闡釋端粒長度的維持以及修復機制，進一步探討植物端粒長度與衰老以及壽命之間的內在關系。端粒酶活性的研究主要集中在動物和人體上，在植物領域該方面的研究相對較少。

種子作為植物的一個主要器官，成熟離體后面臨老化，研究發現，在種子老化過程中端粒長度也呈現一定的變化規律，植物端粒DNA 是一種動態結構，在分化和衰老過程中會縮短，端粒被認為是種子老化的可靠標志。Bucholc 等［7］證明了新鮮和儲存小麥（Triticum aestivum）種子之間端粒序列長度的顯著差異，盡管其在發芽率方面相似。小麥和黑麥（Secale cereale）種子的試驗表明，端粒長度與種子老化呈負相關。Donà 等［8］報道了白玉草（Silene vulgaris）和蠅子草（Silene acaulis）的干燥和再水化種子的平均端粒長度存在顯著差異。復水后，端粒長度明顯增加，人工老化后，端粒長度明顯減少。從這些研究可以看出，在種子人工老化或者自然老化過程中，端粒長度呈現一定的變化規律，但是種子端粒長度與種子所處狀態也有很大的關系。端粒長度以及端粒酶活性的動態變化與種子老化的關系尚不清楚。基于此，本研究綜述了端粒和端粒結合蛋白在植物生物學中的作用，重點論述了端粒和端粒結合蛋白調控端粒長度以及端粒酶活性的模式，為后續解析植物衰老以及種子劣變機理提供理論參考依據。

1 端粒結構及維持機制

1.1 端粒的組成及功能

端粒是染色體末端的重復DNA 序列，人類的通常由TTAGGG 重復單元組成［9］，植物也擁有端粒重復結構，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的重復序列是TTTAGGG，這些重復單元形成了一個末端重復序列，其中一個單元序列朝向染色體內部，另一個朝向染色體外部［10］。端粒通常由兩個主要部分組成：端粒DNA 和端粒結合蛋白。端粒DNA 是端粒的主要結構組成部分，通常由數百至數千個重復單元組成。這些單元由G-四聯體核苷酸和單鏈DNA 結構組成，它們在端粒末端之間形成一個環狀結構（圖1）［11］。端粒DNA 的主要功能是保護染色體末端免受DNA 降解和喪失的影響。端粒結合蛋白是一組與端粒DNA 結合的蛋白質，這些蛋白質主要是幫助穩定端粒結構并保護端粒免受DNA 修復系統的干擾［12］。其次，還參與了基因表達、DNA 復制和染色體結構調節等許多其他生物學過程。

圖1 端粒和端粒酶的結構Fig.1 Structure of telomeres and telomerase

1.2 維持端粒完整和功能的調控機制

端粒長度的維持機制涉及多個分子和信號通路的協同作用：1）端粒酶：端粒酶是一種包含RNA 和蛋白質的酶，能夠調控染色體末端新端粒序列合成［13］，對于端粒長度的維持至關重要，因為端粒在細胞分裂過程中會逐漸縮短，如果沒有端粒酶的參與，染色體末端的縮短會導致基因喪失或染色體重組（圖2）。2）轉錄因子：轉錄因子可以通過直接或間接調節端粒酶的表達來影響端粒長度的維持。例如，轉錄因子NF-κB、SP1 和CREB 等可以激活端粒酶基因的轉錄［14］。3）DNA 損傷反應：DNA 損傷反應的信號通路可以通過ATM、ATR 和p53 等分子激活端粒酶，從而維持端粒長度。當染色體末端遭受到DNA 損傷時，端粒酶可以被招募到損傷部位進行修復，以防止端粒縮短［15］。4）端粒結合蛋白：端粒結合蛋白是一組結合在端粒序列上的蛋白質，能夠維持端粒的結構和功能。例如，端粒蛋白TRF2 可以抑制端粒的融合和修復，從而維持端粒的完整性［16］。5）端粒剪切：在端粒酶合成新端粒序列的過程中，端粒剪切可以將已合成的端粒序列進行修剪，從而控制端粒長度。例如，剪切因子CST 可以調節端粒剪切，影響端粒長度的維持［16］。

圖2 端粒長度及維持機制Fig.2 Telomere length and maintenance mechanism

2 端粒結合蛋白

2.1 端粒雙鏈DNA 結合蛋白

植物端粒結合蛋白（plant telomere binding protein，PTBP）是一種與植物端粒結合的蛋白質，它的主要功能是保護端粒，防止DNA 末端的降解和損傷，并參與維持染色體的穩定性和遺傳信息的傳遞［17］。植物端粒結合蛋白主要存在于植物的細胞核中，具有高度保守性。在不同植物中，PTBP 的序列和結構略有不同，但它們都具有相似的功能和作用機制［18］。PTBP 通常結合在端粒的雙鏈DNA 上，并與其他蛋白質一起形成端粒復合物。這些復合物可以幫助維持染色體的結構和功能，防止染色體斷裂和損傷，從而確保正常的細胞分裂和遺傳信息的傳遞［19］。最近的研究表明，PTBP 在植物的免疫響應和逆境適應中也發揮了重要的作用。OsRTBP1、NgTRF1、AtTBP1 和AtTRB1-3 通過水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana tabacum）和擬南芥中的Myb 結構域與雙鏈端粒DNA 結合［20-23］。據報道，這些含有Myb 結構域的蛋白質與端粒的結合是維持染色體DNA 完整性所必需的［24］。此外，最近的一項研究表明，AtTRB 蛋白還具有染色質調節劑的功能［25］。AtTRB2 與組蛋白脫乙酰酶、HDT4 和HDA6 的直接相互作用調節擬南芥中的染色體末端（表1）。

表1 端粒雙鏈DNA 結合蛋白Table 1 Telomere double-stranded DNA binding protein

盡管CST 復合體最初被認為只存在于酵母中，但現在已知它存在于各種有助于端粒維持的生物體中。在酵母中，CST 復合體包含Cdc13、Stn1 和Ten1，而哺乳動物CST 復合體包含Ctc1、Stn1 和Ten1［26］。 所有3 個CST基因對于端粒維持都是必不可少的［27］。在擬南芥中，任何CST 亞基的突變都可能導致嚴重的形態學缺陷、端粒長度減少、染色體融合或單鏈G 懸垂延伸。CST 復合物控制端粒酶進入端粒DNA、末端連接重組途徑以及擬南芥中ATR 依賴性DNA 損傷反應的激活［28］。

2.2 端粒單鏈DNA 結合蛋白

2.2.1 有OB 結構域的端粒單鏈DNA 結合蛋白 大多數單鏈端粒DNA 結合蛋白含有寡核苷酸/寡糖結合（OB）結構域。包含OB 結構域的蛋白質在端粒維持、DNA 修復、轉錄和其他DNA 代謝過程中發揮重要作用［29］。在植物中，端粒單鏈DNA 序列結合蛋白分為兩組：具有OB 結構域的蛋白質和沒有OB 結構域的蛋白質。第一組具有OB 結構域的蛋白質是POT1。POT1 蛋白是一種高度保守的核心單元，屬于人、酵母和植物等真核生物中極其保守的蛋白，是端粒保護蛋白的一員，在哺乳動物和酵母中已經得到了廣泛的研究。近年來，越來越多的研究表明，植物中POT1 蛋白在端粒保護、基因表達、逆境響應等方面也發揮著重要作用［30］。研究表明，在擬南芥中POT1 蛋白對端粒長度和復制有重要的影響，同時參與了端粒末端的結構和功能的維持。植物POT1 蛋白也參與調控基因表達。一些研究發現，POT1 蛋白能夠通過與轉錄因子相互作用，參與基因的調控。例如，在番茄（Solanum lycopersicum）中，POT1 蛋白能夠調節番茄成熟相關基因的表達［31］。另有研究發現POT1 蛋白能夠響應植物的逆境信號，參與植物的逆境響應。例如，在擬南芥中，POT1 蛋白能夠調節銅離子在植物中的吸收和運輸，并影響植物的抗氧化能力。在植物中分離出POT1 同系物，例如在擬南芥中發現的POT1a、POT1b 和POT1c，這些蛋白均以不同的模式與端粒DNA 單鏈結合，調控端粒的結構和功能（表2）［32］。

表2 端粒單鏈DNA 結合蛋白Table 2 Telomere single-stranded DNA-binding proteins

2.2.2 無OB 結構域的端粒單鏈DNA 結合蛋白 不具有OB 結構域的端粒單鏈DNA 結合蛋白包含：WHY1、STEP1 和GTBP（表2）［33］。 WHY1 最初是作為單鏈DNA 結合轉錄因子分離出來，后來被發現還可以特異性地結合單鏈DNA 并與端粒酶相互作用［34］。STEP1 是葉綠體RNA 結合蛋白cp31 的可變剪接變體，專門定位于細胞核，與單鏈端粒和植物端粒酶相互作用，并阻止端粒酶介導的端粒延伸［34］。WHY1 和STEP1 對端粒酶活性的下調和上調分別表明它們在控制植物端粒穩態方面的獨特作用［35-36］。MYB52 是一種額外的單鏈端粒結合蛋白，它也特異性結合植物端粒DNA 序列，但是其結合能力弱于WHY1 和STEP1［37］。GTBP 也是高度保守的端粒結合蛋白，在煙草中鑒定到3 個GTBP 蛋白，分別是NtGTBP1，NtGTBP2 和NtGTBP3，這3 種NtGTBP 均能在體外以相似的親和力特異性結合植物單鏈端粒重復序列元件。通過RNA 介導的基因敲除方法抑制NtGTBP1，會導致轉基因煙草植株發育缺陷，并伴有端粒延長、染色體外端粒環化和后期端粒結構異常。這些結果均表明，NtGTBP1 的下調導致基因組不穩定，NtGTBP1 是維持端粒穩定的重要因子之一［38］。

3 端粒酶

3.1 端粒酶活性調控模式

端粒長度由端粒酶維持，端粒酶是一種特殊的逆轉錄酶，除了其催化亞基TERT 外，它在延長端粒時攜帶自身的RNA 模板［39］。端粒酶對于植物生長發育至關重要，端粒酶功能障礙導致端粒逐漸縮短和細胞死亡，對擬南芥進行相關觀察時發現，T-DNA 破壞擬南芥中AtTERT基因后，每代端粒DNA 減少250～500 bp，導致從第6 代開始，擬南芥突變體發育異常，并且由于大量基因組不穩定，第10 代后所有突變體全部死亡，這意味著端粒酶對于植物發育是必不可少的。POT1 蛋白AtPOT1a 與AtTERT 催化亞基的N 末端肽相互作用［40］，這些相互作用提供POT1 調節端粒酶活性的機制。此外，AtTRB 蛋白是具有Myb 結構域的端粒雙鏈DNA 結合蛋白，也可以與端粒酶相互作用［41］。研究發現，植物中也存在替代端粒延長（alternative lengthening of telomeres，ALT）的途徑，ALT 機制顯然被激活以響應端粒酶活性的喪失［42］，該結果暗示ALT 可能參與了正常的植物發育，AtKu70 抑制ALT 延長，而ATM 缺陷促進了擬南芥中的ALT 途徑［43］。

單鏈DNA 結合蛋白Whirly1 （WHY1）最初作為轉錄因子被分離出來，后來發現與端粒酶相互作用并特異性結合ssDNA［44］。擬南芥中，AtWHY1 作為端粒酶活性的負調節因子，敲除AtWHY1 突變體顯示端粒長度在幾代中穩定增加。過表達AtWHY1 突變體表現出早期衰老，AtWHY1 在葉片衰老過程中與WRKY53 啟動子區域結合抑制基因表達上調，延緩葉片衰老（圖3Ⅰ）［44］。

圖3 單鏈結合蛋白與端粒DNA 相互作用的不同模式Fig.3 Different patterns of interaction between single-stranded binding proteins and telomere DNA

單鏈端粒結合蛋白STEP1 定位于細胞核，它是葉綠體RNA binding 蛋白cp31 的另一種剪接變體。擬南芥STEP1 與單鏈DNA 相互作用，這種結合是序列特異性的，體外驗證試驗發現，端粒延長被端粒酶介導抑制［45］，這表明AtSTEP1 是一種端粒末端結合蛋白，它通過覆蓋染色體末端和抑制植物中的端粒酶活性來增加端粒長度。AtSTEP1 包含一個部分RBD1 和完整RBD2 的RNA 結合域（RBD）［46］。每個RBD 結構域不能與端粒DNA 序列結合；兩者都是必需的。這一發現與UP1 需要兩種RBD 才能與端粒DNA 結合的觀察結果一致。UP1-DNA 復合物的晶體結構表明，UP1 以二聚體的形式與兩條DNA 鏈結合。其中一條鏈與RBD1 接觸，另一條鏈與RBD2接觸，與端粒酶相互作用，進而調控端粒的結構（圖3Ⅱ）［47］。

多種端粒結合蛋白在同一物種中表達，對端粒維持有不同的貢獻，起著消極和積極的作用，共同調節端粒長度和端粒酶活性［48］。擬南芥中的端粒結合蛋白主要包括STEP1、WHY1、MTB52 和POT1［49］。擬南芥編碼3 個全長POT1 蛋白：AtPOT1a、AtPOT1b 和AtPOT1c 蛋白［49-51］。全長AtPOT1a 和AtPOT1b 不存在單鏈DNA 結合。AtPOT1a 刺激端粒酶的重復添加過程（圖3Ⅲ），而AtPOT1b 與抑制端粒酶活性的調控IncRNA 相互作用（圖3Ⅳ）［52］。AtSTEP1 可能通過覆蓋染色體末端和抑制植物端粒酶活性來增加端粒長度。這些結果表明，端粒結合蛋白通過調節端粒長度和端粒酶活性共同維持端粒穩態。在某種程度上，具有OB 結構域的蛋白起著重要而積極的作用［53］。

3.2 端粒調控植物發育及衰老

最新研究發現，端粒酶逆轉錄酶亞基參與線粒體功能以及相關基因表達調控［54-55］。端粒酶逆轉錄酶基因TERT能夠誘導或者抑制促增殖和抗增殖基因表達促進細胞生長和增殖，在這個過程中不依賴端粒延長，通過這種方式能使細胞在沒有有絲分裂刺激的情況下大量增殖［56］。最新研究發現，TERT 主要定位在細胞核中，能夠調節細胞染色質結構，同時也會快速響應DNA 損傷，啟動DNA 修復通路，同時TERT 能夠以依賴端粒“帽子”的方式穩定端粒結構，在不延長端粒長度的情況下延長細胞壽命［57-58］。TERT 也定位在線粒體中，增加細胞對促凋亡刺激的耐受性，阻斷線粒體死亡途徑，增加細胞的適應性，提高線粒體活性和凋亡抗性［59］。因此將這些功能稱為端粒酶的非端粒功能（圖4）［60］。通過對端粒酶新功能的探索，有助于提高植物的抗逆性，從而延緩植物的衰老進程，為提高作物產量提供一條新途徑。

圖4 端粒酶功能Fig.4 The function of telomerase

4 總結與展望

植物細胞染色體端粒包含特定的重復DNA 序列和結合蛋白，端粒的缺失或者功能異常會導致染色體末端融合和基因缺失，被認為對基因組穩定性至關重要。在植物中已鑒定出很多端粒結合蛋白，并且研究發現，這些蛋白對端粒維持非常重要。然而，植物端粒生物學的許多細節仍未知，例如，前期研究僅僅關注到單個端粒結合蛋白的結構和功能，端粒結合蛋白之間的作用關系尚未深入研究，通過闡明植物中端粒結合蛋白和端粒酶的調控機制，將極大地有助于理解保護和維持染色體末端的分子機制。

迄今為止，與動物中的研究相比，植物中還有許多單鏈DNA 結合蛋白尚未被發現，其功能在植物中也未見報道。自真核生物形成端粒以來，端粒復合結構一直在進化，從酵母到高等動植物，單鏈復合物的組成和結構存在差異。盡管在酵母、動物中的端粒結合蛋白及其對端粒長度和端粒酶活性的調節方面取得了相當大的進展，但關于端粒結合蛋白如何與植物中的端粒DNA 結合的關鍵問題、保護和維持染色體末端的分子機制仍不明確。確定端粒結合蛋白如何影響植物染色體末端的功能和結構是植物科學領域的一個挑戰。隨著對植物端粒和端粒結合蛋白的研究不斷深入，這些蛋白質的研究領域和發展前景也越來越廣闊。在農業生產中，研究植物端粒結合蛋白可以更好地理解植物細胞的老化和死亡機制，從而開發出植物衰老進程調控措施等農業生產技術。