空心蓮子草SOD 基因家族鑒定和表達(dá)模式分析

韓碩，韓曉文，胡義鋒，陳中義，朱永興，尹軍良*

（1. 長(zhǎng)江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025；2. 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3. 長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434025；4. 中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074）

空心蓮子草（Alternanthera philoxeroides）又名喜旱蓮子草，屬莧科蓮子草屬，原產(chǎn)于南美洲，是多年生宿根草本植物，適宜生長(zhǎng)于暖濕氣候地區(qū)，主要的繁殖方式為無性繁殖［1］。空心蓮子草作為一種入侵雜草，不僅給我國(guó)的生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重危害，而且每年至少造成6 億元的經(jīng)濟(jì)損失，2003 年被國(guó)家環(huán)保總局列為首批外來入侵種之一［2］。因此，如何高效防治空心蓮子草已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。

當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，應(yīng)激相關(guān)的代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），例如，超氧自由基（O2·-）、羥基自由基（OH·）、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（1O2），它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答響應(yīng)過程中發(fā)揮著雙重作用［3］。適當(dāng)水平的ROS 可以提高植物對(duì)脅迫的耐受性，但過量則導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化，當(dāng)氧化損傷嚴(yán)重時(shí)，會(huì)導(dǎo)致不可逆的代謝功能損失，甚至造成細(xì)胞死亡［4］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一類抗氧化金屬酶，也是生物體內(nèi)一種重要的活性氧代謝酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成O2和H2O2并進(jìn)一步分解為O2和H2O［5］。在植物中，根據(jù)結(jié)合金屬輔助因子的不同可將SOD 分為銅鋅SOD（Cu/ZnSOD）、鐵SOD（FeSOD）和錳SOD（MnSOD）3 種類型［6］，其家族成員根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域可分為Cu/ZnSOD 和Fe/MnSOD 兩個(gè)亞家族［7］。

研究表明，SOD 在植物響應(yīng)除草劑脅迫中發(fā)揮重要作用，例如，在白菜（Brassicapekinensis）和蘿卜（Raphanussativus）中，氯氟吡氧乙酸處理顯著提高了SOD 活性［8］；在玉米（Zeamays）中，百草枯可使其SOD 活性提高40%，并且促進(jìn)SOD-3 和SOD-4 的蛋白合成［9］；在糜子（Panicummiliaceum）中，2，4-D 異辛酯、滅草松、莠去津等多種除草劑均能使其SOD 活性上升［10］。同時(shí)，空心蓮子草極強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境能力也與SOD 密切相關(guān)，例如Gao 等［11］的研究表明，在干旱脅迫下，空心蓮子草中SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶活性均比水稻（Oryza sativa）高10%～30%，總抗氧化能力比水稻高數(shù)倍［11］；在銅離子脅迫下，當(dāng)銅離子濃度超過0.1 mmol·L-1時(shí)，SOD 活性因O2·-的積累而顯著增強(qiáng)［12］。

1 材料與方法

1.1 ApSODs 鑒定和序列分析

基于文獻(xiàn)報(bào)道收集空心蓮子草基因數(shù)據(jù)［18］，從Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載SOD 蛋白保守結(jié)構(gòu)域（PF00080、PF00081 和PF02777），利用BLASTp 在空心蓮子草氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)（e-value＜le-10）［19］。 并通過Pfam（v35.0，http：//Pfam. xfam. org）和InterProScan（v93.0，http：//www. ebi. ac. uk/InterProScan）進(jìn)行驗(yàn)證，去除重復(fù)、冗余、注釋不完整和不包含SOD 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列［20］。

1.2 ApSODs 系統(tǒng)發(fā)育分析

從擬南芥（Arabidopsis thaliana）信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）、玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. maizegdb. org）、小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//wheat-urgi. versailles. inra. fr/Seq-Repository/Assemblies）和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rice. plantbiology. msu. edu/）中共檢索到8、12、26 和8 個(gè)AtSODs、ZmSODs、TaSODs 和OsSODs。使用ClustalW 2，通過鄰接法（neighbor-joining，replicated-bootstraps 1000）將空心蓮子草SOD 蛋白序列與水稻、小麥、玉米、擬南芥4 個(gè)物種的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)（multiple sequence alignment，MSA）［21］。使用iTOL 工具（interactive tree of life，http：//ITOL. embl. de）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，說明ApSODs 間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，根據(jù)同源性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系對(duì)ApSOD 成員進(jìn)行分類和命名［22］。

1.3 ApSODs 基序（Motifs）和基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)GFF3 基因結(jié)構(gòu)注釋信息，通過TBtools 繪制ApSODs的基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme；基序最佳寬度為6～50 aa；最大基序數(shù)為10）分析ApSODs 的保守基序［23］。利用TBtools 將分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 ApSODs 蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線網(wǎng)站ExPASyServer 10（https：//prosite. expasy. org/PS50011）分析ApSODs 的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度（length， Len）、分子量（molecular weight，MW）、等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）、總親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）［24］。使用Plant-mPLoc（http：//www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plant-multi/？tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）預(yù)測(cè)ApSODs 的亞細(xì)胞定位［23］。使用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）對(duì)ApSODs 進(jìn)行三維同源性建模［25］。

1.5 ApSODs 表達(dá)模式分析

從國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的序列讀取檔案（sequence read archive，SRA）中分別下載空心蓮子草的轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)（PRJNA256237、PRJNA256235、PRJNA268359 和PRJNA263573）［26］。計(jì)算ApSODs的每百萬轉(zhuǎn)錄本數(shù)（transcripts per million，TPM）并對(duì)其進(jìn)行l(wèi)og2（TPM+1）轉(zhuǎn)換［27］，利用R 軟件包pheatmap 生成基因在不同組織不同條件下的表達(dá)模式圖［28］。

1.6 miRNA 靶向關(guān)系預(yù)測(cè)

從已報(bào)道文獻(xiàn)中收集空心蓮子草miRNA 成熟序列［18］，將編碼序列（coding sequence，CDS）和miRNA 序列上傳至psRNA Target（https：//www. zhaolab. org/psRNA Target/），并使用R 軟件包ggalluvia 繪制miRNA 與ApSODs間的靶向關(guān)系圖［29］。

1.7 樣品處理

試驗(yàn)于2022 年10 月中旬在湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田（112°08′56.498″ E，30°21′31.851″ N）中進(jìn)行，采用野生型空心蓮子草，其植株高度為10～15 cm，覆蓋率為100%。用41%草甘膦、50%異丙隆、13%噁草酮、10%乙羧氟草醚和20%氯氟吡氧乙酸這5 種除草劑進(jìn)行處理，每個(gè)小區(qū)為1 m×1 m，每個(gè)處理噴施藥液量為250 mL，每個(gè)處理重復(fù)3 次，空白對(duì)照為清水。分別在處理后0.5、1、3、5、7 d 觀察空心蓮子草表型變化，并收集頂端葉片，-80 ℃保存。供試藥劑及濃度如表1 所示。

For an abrupt junction, the capacitance of the junction is related to the reverse bias potential by[31]:

表1 試驗(yàn)藥劑和濃度Table 1 Test the agent and the concentration

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）表達(dá)分析

使用TRizol 試劑（GenStar，北京，中國(guó)）提取植物總RNA，并用DNaseI（TaKaRa，大連，中國(guó)）去除DNA。利用RevertAid 逆轉(zhuǎn)錄酶（Vazyme，南京，中國(guó)）將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用PrimerPremier 5 軟件設(shè)計(jì)ApSOD基因特異性引物（表2）。使用SYBR GreenMaster Mix（Vazyme，南京，中國(guó)）進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μL：正、反向引物各0.4 μL、10 μL 2×SYBR Premix Extaq、2 μL cDNA，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s（步驟1）；95 ℃變性5 s（步驟2），60 ℃退火/延伸和熒光信號(hào)采集30 s（步驟3）；步驟2 和3 循環(huán)40 次。使用2-ΔΔCt方法［30］計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

表2 ApSODs 基因的RT-qPCR 引物Table 2 RT-qPCR primers for ApSODs genes

1.9 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。使用t檢驗(yàn)來計(jì)算平均值之間的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ApSODs 鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過BLASTp 比對(duì)，并利用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，最終鑒定獲得43 個(gè)空心蓮子草ApSOD 基因家族成員。根據(jù)單物種的結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育樹所示的進(jìn)化關(guān)系，將其分別命名為ApSOD1～22（屬于Cu/ZnSOD 亞家族）和ApSOD23～43（屬于Fe/MnSOD 亞家族）［31-32］。將空心蓮子草、水稻、小麥、玉米和擬南芥5 個(gè)物種的SOD蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AtSOD 與ApSOD 位于同一個(gè)進(jìn)化分支的成員數(shù)最多，表明它們之間的進(jìn)化關(guān)系最近。

圖1 空心蓮子草、水稻、小麥、玉米和擬南芥SODs 的進(jìn)化關(guān)系Fig.1 Evolutionary relationships of A. philoxeroides， O. sativa， T. aestivum， Z. mays and A. thaliana SODs

2.2 ApSODs 基因結(jié)構(gòu)和保守Motif 分析

ApSODs基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，長(zhǎng)度均較短，并且所有的ApSODs均不含內(nèi)含子，其中，ApSOD3/7/9/11/12/14/15/21/29/32/35/36/39/41在5′和3′端都含有非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR）；ApSOD1/6/10/22/25/26/30/31/33/39/40/43僅在一端含有UTR（圖2B）。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，ApSODs 蛋白的10 個(gè)基序在不同亞家族中的分布具有差異（圖2A），每個(gè)ApSOD 都含有1～6 個(gè)保守基序。其中，ApSOD5/10/24/33/34/39/40/41/42 僅含有1 個(gè)Motif；ApSOD12 含有的Motif 最多，為6 個(gè)（圖2C）。Motif1/2/5/7/8/9 構(gòu)成了SOD 關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，其中，Motif1/2/7 為Sod_Cu/Zn 結(jié)構(gòu)域，Motif5/8/9 為Sod_Fe/Mn 結(jié)構(gòu)域（圖2D）。

圖2 ApSODs 基因家族的基因結(jié)構(gòu)、保守基序和結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Gene structure， conserved Motif and domain analysis of ApSODs gene family

圖3 ApSODs 的3D 模型預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted 3D models of ApSODs

2.3 ApSODs 蛋白特征和三維結(jié)構(gòu)

ApSODs 蛋白平均長(zhǎng)度為194 aa，分布在61～481 aa（表3）。蛋白平均分子量為17.80 kDa，分布在6.98～50.96 kDa，其中ApSOD17 分子量最大，為50.96 kDa，其余蛋白均小于35 kDa。蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)平均值為6.86，分布在5.18～11.11，其中30 個(gè)ApSODs 等電點(diǎn)小于7，為酸性蛋白質(zhì)，其余ApSODs 均為堿性蛋白。ApSODs 蛋白的疏水性指數(shù)（GRAVY）的平均值為-0.25，除ApSOD9、ApSOD13、ApSOD14、ApSOD15、ApSOD20、ApSOD27、ApSOD40 蛋白外，其余ApSOD 蛋白均為親水蛋白（GRAVY＜0）。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)平均值為29.80，分布在6.39～62.36，其中6 個(gè)ApSODs 為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)＞40），其余則為穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，在Zn/CuSOD 亞家族成員中，有21 個(gè)分布在葉綠體或細(xì)胞質(zhì)中，ApSOD3 僅分布在線粒體中，ApSOD7 可能分布在線粒體和細(xì)胞核內(nèi)；在Fe/MnSOD 亞家族成員中，有20 個(gè)僅分布在線粒體中，ApSOD35 僅分布在葉綠體中。

表3 ApSODs 蛋白質(zhì)特征分析Table 3 Protein characterization of ApSODs

三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ApSODs 蛋白主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和隨機(jī)卷曲構(gòu)成（圖 3），其中在Cu/ZnSOD 中，隨機(jī)卷曲占比較大（29.91%～70.37%），平均值為46.89%；其次是延伸鏈（11.88%～35.90%），平均值為27.40%，再次是α-螺旋（2.47%～37.22%），平均值為15.24%；β-轉(zhuǎn)角占比較小（3.70%～18.80%），平均值為10.46%；在Fe/MnSOD 中，α螺旋占比較大（22.97%～73.20%），其次是隨機(jī)卷曲（18.56%～43.04%），平均值為31.13%，再次是延伸鏈（2.06%～37.70%），平均值為20.34%，最后是β-轉(zhuǎn)角（5.06%～14.86%），平均值為9.30%。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，位于同一分支的蛋白結(jié)構(gòu)越相似。

2.4 ApSODs 表達(dá)模式分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA256237、PRJNA256235、PRJNA268359 和PRJNA263573）分析ApSODs在不同組織和不同處理下的表達(dá)模式。ApSOD8/9/11/21/25/26/35/36/41/42/43的表達(dá)水平普遍較高，而其他ApSODs僅在個(gè)別組織或處理下表達(dá)，且表達(dá)水平相對(duì)較低（圖4）。在不同的水分環(huán)境中，ApSODs的表達(dá)水平差異不大，ApSOD8/11/21/35在陸地樣本中的表達(dá)水平整體高于池塘樣本，ApSOD25/37/41/42/43在池塘樣本中的表達(dá)水平整體高于陸地樣本。在低鉀脅迫下，ApSOD2/5/6/12/16/17/19/20/24/29/31/33/35/39在根系組織中的表達(dá)水平上升，ApSOD10/22/27/34的表達(dá)水平下降。此外，在上海收集的“中央”種群和山東濟(jì)南收集的“北方”種群中ApSOD7/19/9表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致，上部第1 對(duì)葉片中最高，第2 對(duì)次之，第3 對(duì)最低，而ApSOD35/36在兩個(gè)種群中表達(dá)水平差異較大。

2.5 miRNA 對(duì)ApSODs 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

17 個(gè)空心蓮子草miRNA 通過切割和翻譯抑制作用靶向14 個(gè)ApSODs基因，aph-miR11004、aph-miR1171b、aph-miR6034c 和aph-miR8706 共同靶向ApSOD17；aph-miR11004、aph-miR171、aph-miR5049b、aph-miR6034c、aph-miR8706 同時(shí)靶向ApSOD32、ApSOD21；aph-miR1023、aph-miR1134b、aph-miR11418、aph-miR1171a、aphmiR1171b、aph-miR482a 分別靶向1 個(gè)ApSOD基因；aph-miR1097、aph-miR11045、aph-miR1134c 靶向2 個(gè)ApSOD基因（圖5）。除aph-miR1134c、aph-miR11045 以外的所有的miRNAs 均可通過切割作用調(diào)控ApSOD基因的表達(dá)，而aph-miR1134c、aph-miR11045 是通過翻譯抑制作用來調(diào)控ApSOD基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明，多個(gè)miRNA 靶向ApSODs并形成miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與到ApSODs的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控。

2.6 不同除草劑對(duì)空心蓮子草的防效

不同除草劑對(duì)空心蓮子草藥效差異明顯（圖6）。13%噁草酮藥后3 d 時(shí)，空心蓮子草頂部幼嫩葉片出現(xiàn)退綠現(xiàn)象；20%氯氟吡氧乙酸藥后5 d 時(shí)，葉片黃化，并在7 d 時(shí)萎蔫枯死，停止生長(zhǎng)；10%乙羧氟草醚藥后5 d 時(shí)，葉片出現(xiàn)失綠黃化現(xiàn)象；41%草甘膦藥后7 d 時(shí)，頂端葉片黃化，并出現(xiàn)枯斑；50%異丙隆在藥后7 d 內(nèi)無明顯變化。綜上所述，防除效果為13%噁草酮≥20%氯氟吡氧乙酸＞10%乙羧氟草醚＞41%草甘膦＞50%異丙隆。

圖6 5 種除草劑對(duì)空心蓮子草生長(zhǎng)的影響Fig.6 Influence of five herbicides on A. philoxeroides growth

2.7 RT-qPCR 分析

為了進(jìn)一步了解ApSODs在5 種除草劑下的表達(dá)特征，本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，挑選了1 個(gè)高表達(dá)（ApSOD11）和5 個(gè)差異表達(dá)（ApSOD8/9/21/35/43）的ApSOD基因，利用RT-qPCR 分析除草劑脅迫下其相對(duì)表達(dá)水平（圖7）。

圖7 不同除草劑處理下ApSODs 的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression levels of ApSODs under different herbicides treatments

在13%噁草酮處理中，ApSOD8和ApSOD9的表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致，在1～3 d 時(shí)表達(dá)水平顯著降低，并在5 d 時(shí)顯著上升且高于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.8 和1.5 倍；而ApSOD21在處理0.5 d 時(shí)被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，隨后在1 d 時(shí)顯著降低，均不足對(duì)照的30%。ApSOD35的表達(dá)量隨處理點(diǎn)的延長(zhǎng)而上調(diào)表達(dá)，隨后表達(dá)量下降，而在5 d 時(shí)再次被顯著誘導(dǎo)；ApSOD43呈現(xiàn)先上升后下降再回升的趨勢(shì)，在1 d 時(shí)陡然下降且不足對(duì)照的14%。

在10%乙羧氟草醚處理中，ApSOD9/21/8/35隨著時(shí)間的增加而顯著上調(diào)表達(dá)，但3 d 后表達(dá)水平下降，下降幅度分別為對(duì)照的24%、32%、15%、62%；而ApSOD11在0.5～7 d 的表達(dá)量均較低，且表達(dá)水平下降幅度為對(duì)照的6%～9%。

在20%氯氟吡氧乙酸處理中，ApSOD8/9/21/35均在0.5 d 時(shí)被顯著上調(diào)表達(dá)，并達(dá)到峰值，其中ApSOD9在處理后1～7 d 的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，而ApSOD35在1 d 時(shí)陡然下降，隨后表達(dá)量逐漸上升；ApSOD43呈現(xiàn)先下降后回升再下降的趨勢(shì)；ApSOD11在7 d 內(nèi)表達(dá)水平均很低，不足對(duì)照的10%。

在41%草甘膦處理中，ApSOD11/21/43在1 d 時(shí)表達(dá)水平顯著升高，其中ApSOD21和ApSOD43與對(duì)照相比均升高8 倍。隨后表達(dá)水平迅速降低，ApSOD11表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的4%，ApSOD21/43為對(duì)照的20%左右。ApSOD9/8/35在7 d 時(shí)與對(duì)照相比表達(dá)水平升高。其中ApSOD21和ApSOD43的表達(dá)水平在1 d 時(shí)均增加了8 倍。

在50%異丙隆處理中，ApSOD21/43/8在0.5 d 時(shí)的表達(dá)水平達(dá)到峰值，隨后在1 d 時(shí)下降至最低點(diǎn)；而ApSOD9/35在3 d 時(shí)表達(dá)水平顯著升高，其中ApSOD35與對(duì)照相比上升幅度約為34 倍。此外，ApSOD11在7 d內(nèi)的表達(dá)水平均低于對(duì)照，在1 d 時(shí)僅為對(duì)照的0.5%。

3 討論

空心蓮子草具有極強(qiáng)的再生能力和傳播能力，是一種全球公認(rèn)極難防除的惡性入侵雜草［33］，在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。相關(guān)研究表明，噁草酮、氯氟吡氧乙酸、乙羧氟草醚、草甘膦、異丙隆等除草劑可以有效防治空心蓮子草［34-36］。SOD 作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，在清除過量ROS 過程中發(fā)揮著重要作用［37］。此外，SOD 在植物響應(yīng)除草劑中發(fā)揮著重要作用。然而，到目前為止，SOD 在空心蓮子草響應(yīng)除草劑中的表達(dá)模式尚不清楚。因此，開展空心蓮子草ApSODs基因的系統(tǒng)鑒定和分析，揭示其在除草劑脅迫中的響應(yīng)模式，可為后期深入分析ApSOD響應(yīng)除草劑脅迫的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

本研究從空心蓮子草中鑒定到43 個(gè)ApSODs，并根據(jù)結(jié)構(gòu)域?qū)⑵鋭澐譃? 個(gè)亞家族（圖1），分別為Cu/ZnSOD（ApSOD1～22）和Fe/MnSOD（ApSOD23～43）。研究表明，大多數(shù)Zn/CuSOD 定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，但也有些存在于線粒體和細(xì)胞核中，大部分Fe/MnSOD 定位于線粒體和葉綠體中［38-40］。例如，在丹參（Salviamiltiorrhiza）中，3 個(gè)Cu/ZnSOD 定位于細(xì)胞質(zhì)中，2 個(gè)FeSOD 定位于葉綠體中，3 個(gè)MnSOD 定位于線粒體中；在高粱（Sorghumbicolor）中，SbSOD1/2/3/5 定位于細(xì)胞質(zhì)中，SbSOD4/7/8 定位于葉綠體中，SbSOD6 定位于線粒體中。本研究預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，21 個(gè)Zn/CuSOD 分布在葉綠體或細(xì)胞質(zhì)中，其余可能分布在線粒體和細(xì)胞核內(nèi)；20 個(gè)Fe/MnSOD 分布在線粒體中，僅ApSOD35 分布在葉綠體中。由預(yù)測(cè)分析結(jié)果推測(cè)，Zn/CuSOD 可能主要在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中發(fā)揮作用，F(xiàn)e/MnSOD 主要在線粒體和葉綠體中發(fā)揮作用。

前人研究發(fā)現(xiàn)，在番茄（Solanum lycopersicum）中，除SlSOD6、SlSOD8在幼果中表現(xiàn)出組織特異性外，其余基因均在根、葉、芽、花等組織中高表達(dá)［41］；小麥SOD基因幾乎在所有組織中均有表達(dá)［17］；在棉花（Gossypium hirsutum）中，ZmSODs在花中表達(dá)量較高，且開花后較開花前表達(dá)量有所增加［42］。類似地，在本研究中，ApSODs家族成員也具有組織和時(shí)空特異性，其中ApSOD6/7/9/19/23/24/33/34/39/40/41基因在不同組織（根部、葉片組織、莖節(jié)組織）和不同脅迫處理（低鉀脅迫、不同水分環(huán)境）下的表達(dá)水平均較高。同時(shí)，在不同的水分環(huán)境中ApSOD表達(dá)水平變化趨勢(shì)相似。在低鉀脅迫下，ApSODs的表達(dá)水平整體呈上升趨勢(shì)，表明SOD響應(yīng)低鉀脅迫。在山東濟(jì)南收集的“北方”種群和上海收集的“中央”種群中，除ApSOD33/34在兩個(gè)種群中差異較大外，其余ApSODs的表達(dá)水平相差不大。綜上所述，空心蓮子草ApSOD的表達(dá)水平受緯度、海拔、溫度、光照、水分等條件的影響較小。但是ApSODs的表達(dá)可能受到特定環(huán)境條件的誘導(dǎo)，例如干旱［11］、高溫［43］等脅迫。

不同除草劑對(duì)空心蓮子草的防除效果為13%噁草酮≥20%氯氟吡氧乙酸＞10%乙羧氟草醚＞41%草甘膦＞50%異丙隆。防效測(cè)定結(jié)果顯示，13%噁草酮處理藥后3 d 時(shí)出現(xiàn)頂葉失綠白化現(xiàn)象，5 d 時(shí)頂葉枯萎加重，7 d 時(shí)完全枯死并停止生長(zhǎng)。在高宗軍等［34］的研究中，12%噁草酮藥后3 d 時(shí)葉片白化、干卷，本研究結(jié)果與此一致。20%氯氟吡氧乙酸藥后5 d 時(shí)植株出現(xiàn)失綠現(xiàn)象，在7 d 時(shí)植株完全枯萎黃化。黃蔚蘭［44］的研究發(fā)現(xiàn)，空心蓮子草在氯氟吡氧乙酸藥后2 d 時(shí)開始萎蔫；4 d 葉片發(fā)黃、莖稈萎蔫；6 d 葉片大面積枯死。10%乙羧氟草醚藥后3 d 時(shí)頂葉開始枯萎，5 d 時(shí)頂葉枯萎加重，植株失綠黃化，7 d 時(shí)頂葉完全枯萎停止生長(zhǎng)。在高宗軍等［34］的研究中，20%乙羧氟草醚藥后5 d 時(shí)頂葉卷曲、枯萎，本研究結(jié)果與之相似。41%草甘膦藥后7 d 時(shí)頂葉失綠，出現(xiàn)枯斑。婁遠(yuǎn)來等［45］研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦施用3 d 后植株葉片下垂、葉片出現(xiàn)枯斑，10 d 左右地上部枝條逐漸枯死。50%異丙隆處理藥后7 d 內(nèi)均無變化。高宗軍等［34］的研究表明，異丙隆是一種低毒持效型除草劑，50%異丙隆（WP）在藥后10 d 時(shí)才會(huì)引起植株死亡。推測(cè)這些差異可能是藥劑濃度不同所導(dǎo)致。

前人研究發(fā)現(xiàn)，SOD 在植物響應(yīng)除草劑脅迫中發(fā)揮重要作用。例如，在水稻中，噁草酮藥后12 d 能顯著提高SOD、CAT 和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等抗氧化酶活性，并且除草劑的效果隨著抗氧化酶活性的提高而降低［46］；在谷子（Setaria italica）中，低濃度（有效成分為2 L·hm-2）的氯氟吡氧乙酸在藥后5～10 d 內(nèi)能顯著誘導(dǎo)SOD 活性升高［47］；在葡萄（Vitis vinifera）中，較低濃度的乙羧氟草醚在藥后30 d 時(shí)能顯著提高中上部葉片的SOD 活性［48］；在苦草（Vallisneria natans）中，各濃度下的草甘膦均能夠不同程度地提高SOD 活性［49］；在小麥中，隨著異丙隆處理濃度的增加，SOD 活性顯著上升，在異丙隆濃度為10 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最大值；而在一定范圍內(nèi)，SOD 同工酶的活力也逐漸增強(qiáng)［50］。本研究借助RT-qPCR 分析了ApSODs在除草劑脅迫下的表達(dá)特征，結(jié)果表明在噁草酮脅迫中，ApSOD21/35在藥后0.5 d 時(shí)表達(dá)水平顯著提高，ApSOD8/9/35在5 d 時(shí)被高度誘導(dǎo)。在氯氟吡氧乙酸脅迫中，ApSOD8/9/21/35在藥后0.5 d 時(shí)被高度誘導(dǎo)，ApSOD35在藥后3 d 時(shí)表達(dá)水平持續(xù)上升，在7 d 時(shí)達(dá)到峰值。在乙羧氟草醚脅迫中，ApSOD8/9/21/35在藥后0.5 d 時(shí)被顯著誘導(dǎo)，并且ApSOD8/9/35在藥后5 d 時(shí)再次被顯著誘導(dǎo)，在藥后7 d 時(shí)表達(dá)水平仍顯著高于對(duì)照。在草甘膦脅迫中，ApSOD11在0.5 d時(shí)表達(dá)水平顯著上升，ApSOD21/43在1 d 時(shí)被顯著誘導(dǎo)，ApSOD8/9/35在7 d 時(shí)表達(dá)水平顯著上升。在異丙隆脅迫中，ApSOD8/9/21/35/43的表達(dá)水平在0.5 d 時(shí)被顯著誘導(dǎo)。綜上所述，ApSODs在5 種除草劑脅迫中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，均參與空心蓮子草對(duì)除草劑脅迫應(yīng)答過程。

4 結(jié)論

本研究從空心蓮子草中鑒定出了22 個(gè)Cu/ZnSOD 和21 個(gè)Fe/MnSOD；22 個(gè)Cu/ZnSOD 中有21 個(gè)被預(yù)測(cè)定位在葉綠體或細(xì)胞質(zhì)中，而21 個(gè)Fe/MnSOD 中20 個(gè)被預(yù)測(cè)定位在線粒體中；ApSOD的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，受緯度、海拔、溫度、光照、水分等條件的影響較小；防效測(cè)定結(jié)果為13%噁草酮≥20%氯氟吡氧乙酸＞10%乙羧氟草醚＞41%草甘膦＞50%異丙隆；RT-qPCR 分析結(jié)果表明，ApSODs在不同脅迫時(shí)間點(diǎn)被除草劑誘導(dǎo)差異表達(dá)，從而參與空心蓮子草對(duì)除草劑脅迫應(yīng)答的調(diào)控。