神農(nóng)香菊CibHLH1 的鑒定及對光合特性的影響

韓金秀，陳斌，劉晏廷，孟儒，金利妍，何淼*

（1. 東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 蘇州大學教育學院，江蘇 蘇州 215006）

高山植物是指生長在高山樹線及上至雪線的山地植物［1］，為應對低溫、強輻射等逆境危害，進化出了獨特的適應機制［2］。光合作用是植物生命活動中最重要的生理過程，易被光照、溫度和水分等環(huán)境因子影響［3-5］。研究表明高山植物會通過降低葉片中光合色素的含量來減少對光能的吸收，從而減輕輻射傷害［2］。米櫧（Castanopsis carlesii）［6］、古茶樹（Camellia sinensis）［7］、短肋羽蘚（Thuidium kanedae）［8］和美麗風毛菊（Saussurea superba）［9］中的葉綠素含量均隨海拔升高而降低。而神農(nóng)香菊（Chrysanthemum indicumvar.aromaticum）作為原產(chǎn)于神農(nóng)架2600 m 以上地帶的菊屬芳香植物資源［10］，具有重要的觀賞和應用價值。課題組在前期引種栽培時發(fā)現(xiàn)，引種至低海拔地區(qū)的植株葉色明顯深于原生地，與前人的研究結果一致［6-9］。因此，研究神農(nóng)香菊的光防御機制可為了解高山植物的生長特性提供新思路。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子是廣泛存在于真核生物中的轉錄因子超家族之一［11］，其成員均含有堿性區(qū)域（basic region）和螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）區(qū)域兩個保守結構域，其中堿性區(qū)域是DNA 結合區(qū)，特異性識別E-box 和G-box 基序；HLH 區(qū)位于C 端，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達［12-13］。bHLH 家族在植物中種類繁多，功能各異，廣泛地參與種子萌發(fā)［14-15］、形態(tài)建成［16-17］、分支發(fā)育［18-19］和果實的形成［20-22］等生物進程。同時，bHLH 轉錄因子也被證實參與植物光合作用的調(diào)控。擬南芥（Arabidopsis thaliana）bHLH 家族光敏色素相互作用因子（phytochrome interacting factors，PIFs）在黑暗條件下冗余地抑制光形態(tài)發(fā)生［23］，其中PIF5 可以與SGR、NYC、ORE1基因啟動子區(qū)域的G-box 結合正向調(diào)控黑暗誘導的葉綠素的降解［24］。番茄（Solanum lycopersicum）bHLH 家族SlPRE3也負調(diào)控葉綠素的合成，進而影響植株光合產(chǎn)物的積累［25］。bHLH 也可以正向調(diào)控光合作用，MdbHLH3調(diào)控MdPFPβ的表達，增強了葉片的光合碳同化能力，顯著增加了植株的碳水化合物含量［26］。然而目前在菊科植物的研究中，關于bHLH 轉錄因子參與植物光合生理調(diào)控的機理尚不明晰。因此，本研究從神農(nóng)香菊葉片cDNA 中克隆出一個bHLH 轉錄因子，并進行序列和表達模式分析，通過構建過表達CibHLH1煙草（Nicotiana tabacum）株系，測定過表達煙草株系的葉綠素含量和光合指標，分析CibHLH1對光合生理的調(diào)控機制，從基因層面為探究高山植物應對強光輻射的適應機制奠定理論基礎，同時也為培育適應性強的園藝植物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 CibHLH1 基因的克隆和序列分析

在實驗室已獲得的UV-B 處理神農(nóng)香菊轉錄組數(shù)據(jù)中，篩選得到一個差異上調(diào)表達的注釋為bHLH 類轉錄因子的Unigene，用Premier 5.0 軟件設計特異性引物bHLH-F/bHLH-R(表1)。2015 年3 月以東北林業(yè)大學園林學院苗圃連續(xù)種植兩年且生長良好的神農(nóng)香菊葉片cDNA 為模板進行PCR 擴增，利用NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對獲得的基因全長序列進行功能鑒定，并選取同源性較高的序列使用DNAMAN 和MEGA 5.0 軟件進行同源性比對及進化樹的構建［27］。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2 表達模式分析

選取長勢一致且健壯的神農(nóng)香菊植株，提取其根、莖、葉和花的RNA，反轉錄為cDNA 作為模板。以CmUBI為內(nèi)參基因，設計CmUBI和CibHLH1的熒光定量引物CmUBI-F/CmUBI-R 和bHLH-1-F/bHLH-1-R（表1）。參照東洋紡熒光定量試劑盒（TOYOBO，日本）說明書進行熒光定量試驗，所有試驗均生物學重復3 次。采用2-ΔΔCT法［28］對CibHLH1基因的表達量進行分析。

1.3 植物表達載體的構建

使用Premier 5.0 軟件設計含酶切位點KpnI、SpeI 的特異性引物CibHLH1-KpnI/CibHLH1-SpeI（表1）對CibHLH1基因開放閱讀框（open reading frame， ORF）的630 個堿基進行PCR 擴增，將目的片段膠回收后連接克隆載體并轉大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞（唯地，上海）。使用天根質粒小提試劑盒（TIANGEN，北京）提取含有目的片段的pEASY-Blunt：：CibHLH1陽性質粒。用限制性內(nèi)切酶KpnI 和SpeI（Taraka，大連）對已構建含有該位點的pEASY-Blunt：：CibHLH1質粒及實驗室保存的pBI121-GFP空載體分別進行雙酶切。將線性化的pBI121-GFP空載體和目的基因片段用T4連接酶（Taraka，大連）連接后，轉化大腸感受態(tài)，用pBI121 通用引物pBI121-T-F/pBI121-T-R（表1）進行菌液PCR 驗證后送出測序，獲得重組植物表達載體pBI121-GFP：：CibHLH1。

1.4 基因槍法轉化洋蔥表皮細胞

用構建好的pBI121-GFP：：CibHLH1質粒和實驗室保存的pBI121-GFP空質粒作為DNA 子彈，使用GJ-1000 高壓氣體基因槍（美國）轟擊洋蔥（Allium cepa）表皮，暗培養(yǎng)12～24 h 后，在共聚焦顯微鏡（LSM 980，德國）下觀察并拍照［29］，試驗進行3 次生物學重復。

1.5 煙草的轉化及轉基因植株的鑒定

將重組質粒pBI121-GFP：：CibHLH1使用凍融法轉化EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)（唯地，上海），將PCR 擴增驗證正確的菌液保存用于遺傳轉化。采用葉盤法［30］侵染煙草，用卡那霉素（kanamycin，Kana）進行抗性篩選。待長出不定芽，轉移到生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，長出4～6 片真葉后，選取生長狀態(tài)良好的轉基因煙草，提取RNA 進行PCR 驗證。將陽性煙草移栽至營養(yǎng)土中，收取T0代種子點播至含有Kana 的發(fā)芽培養(yǎng)基中，獲得陽性幼苗繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復至獲得T3代轉基因植株用于生理生化指標測定。

1.6 轉基因煙草表型及光合指標的測定

選取長勢一致且健壯的T3代轉CibHLH1基因煙草（B1、B2），轉pBI121-GFP空載體煙草（empty vector，EV）和野生型煙草（wild type，WT）各30 株用于表型及光合指標的測定。參照張紀利等［31］的方法測定葉綠素含量，每個株系選擇3 株。每個株系選取長勢良好的3 株，取其第3 片功能葉進行光合指標的測定。在上午9：00-11：00用Li-6400 光合儀（美國）測定煙草葉片的光合參數(shù)。用紅藍光源標準葉室設定光合有效輻射強度為：2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1，葉室溫度控制在（24±1） ℃，相對濕度控制在60%～70%，CO2濃度為400 μmol·mol-1，待葉室穩(wěn)定讀取凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、胞間二氧化碳濃度（intercellular CO2concentration，Ci）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs），蒸騰速率（transpiration rate，Tr），并且計算水分利用率（water use efficiency，WUE），其中WUE=Pn/Tr。以上指標測定均進行3 次生物學重復。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，采用Microsoft Excel 2019 軟件整理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結果與分析

2.1 神農(nóng)香菊CibHLH1 基因的克隆及序列分析

以神農(nóng)香菊cDNA 為模板，bHLH-F/bHLH-R 為引物進行PCR 擴增，獲得了一條750 bp 左右的特異性條帶。將序列提交NCBI Conserved Domains 進行鑒定，測定其具有完整的bHLH 家族的保守結構域，因此認定該基因屬于bHLH 家族，并命名為CibHLH1（GenBank 登錄號為MG816465）。CibHLH1基因全長為738 bp，具有完整的長為630 bp 的開放閱讀框，編碼210 個氨基酸（圖1）。

圖1 CibHLH1 基因核苷酸序列及氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of CibHLH1 gene

2.2 CibHLH1 基因的系統(tǒng)進化樹構建和多序列比對分析

將CibHLH1序列提交到NCBI 網(wǎng)站上進行blast 分析，選取相似度較高的不同物種的基因構建進化樹（圖2）。神農(nóng)香菊CibHLH1基因與菊花（Chrysanthemum morifolium）CmbHLH1的同源性最高。

圖2 CibHLH1 基因進化分析Fig.2 Evolution analysis of CibHLH1

將構建進化樹所用的基因序列與CibHLH1基因用DNAMAN 軟件進行多序列比對（圖3），結果顯示CibHLH1所編碼氨基酸序列與菊花CmbHLH1相似性高達90%，因此推測CibHLH1蛋白的功能與CmbHLH1相似。

圖3 CibHLH1 基因氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of CibHLH1

2.3 CibHLH1 基因的表達模式分析

采用實時熒光定量PCR 方法檢測CibHLH1基因在神農(nóng)香菊不同部位的表達量。以根中的表達量為1 進行計算，結果表明（圖4），CibHLH1基因在根中的表達量最低；在花中的表達量最高，是根的7.5 倍；在葉和莖中的表達量分別是根的7.0 和5.5 倍。

圖4 CibHLH1 在神農(nóng)香菊不同部位的表達量分析Fig. 4 Analysis of CibHLH1 expression in different parts of C. indicum var. aromaticum

2.4 CibHLH1 基因亞細胞定位

采用雙酶切的方法將CibHLH1目的基因片段與pBI121-GFP植物表達載體進行連接，將陽性菌液過夜培養(yǎng)后送測序，結果與目的片段完全一致，至此pBI121-GFP：：CibHLH1植物表達載體成功構建。將pBI121-GFP空載體和攜帶目的基因的pBI121-GFP：：CibHLH1質粒分別在洋蔥表皮細胞中瞬時表達，在共聚焦顯微鏡下觀察。pBI121-GFP空載體侵染的洋蔥表皮細胞在細胞膜和細胞核處均可見綠色熒光（圖5），而打入pBI121-GFP：：CibHLH1的洋蔥表皮細胞只在細胞核處觀察到熒光，說明CibHLH1基因定位在細胞核中。

圖5 CibHLH1 基因在洋蔥表皮中的定位Fig.5 Localization of CibHLH1 gene in onion epidermis

2.5 轉基因煙草的獲得

用凍融法將構建好的pBI121-GFP：：CibHLH1植物表達載體和pBI121-GFP空載體轉入農(nóng)桿菌中，分別侵染煙草。選取生長良好的轉基因煙草，提取RNA，反轉錄為cDNA 作為模板，用pBI121 通用引物進行PCR 驗證，共鑒定出5 株轉基因煙草（圖6）。選取長勢健壯的B1、B2兩個轉CibHLH1基因煙草株系用于后續(xù)生理試驗。

圖6 陽性轉基因煙草的鑒定Fig.6 Identification of positive transgenic tobacco

2.6 轉CibHLH1 基因煙草的形態(tài)特征

在轉基因煙草發(fā)芽階段觀察發(fā)現(xiàn)（圖7），轉基因株系B1和B2的葉片顏色明顯黃于對照組EV 和WT。待其生長出6～7 片葉子后再次進行觀察，B1和B2的葉片顏色為黃綠色，與EV 和WT 相比明顯黃化。據(jù)此推測CibHLH1基因調(diào)控煙草葉綠素的合成。

圖7 不同株系的葉形態(tài)對比Fig.7 Comparison of leaf morphology of different strains

2.7 轉基因煙草葉綠素含量的測定

CibHLH1過表達煙草的葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量均顯著降低（圖8），其中葉綠素a 的平均值為WT和EV 的32.50%、33.10%，葉綠素b 平均值為WT 和EV 的33.50%、43.10%，總葉綠素平均值降至WT 和EV 的33.10%、37.70%。

圖8 不同株系的葉綠素含量Fig.8 Chlorophyll content of different strains

2.8 轉基因煙草光響應曲線及參數(shù)的測定

轉CibHLH1基因煙草株系（B1、B2）和對照組（WT、EV）的光合-光響應曲線擬合狀態(tài)良好，4 個株系對光響應的趨勢基本一致（圖9）。當光合有效輻射（photosynthetically active radiation，PAR）＜200 μmol·m-2·s-1時，Pn隨PAR 的增加呈線型增長，增長迅速；當200 μmol·m-2·s-1≤PAR≤600 μmol·m-2·s-1時，Pn的增長趨于緩慢，轉基因株系達到光飽和點，而對照組株系的Pn隨PAR 增加繼續(xù)緩慢增長，至PAR 為800 μmol·m-2·s-1時，達到光飽和點。將轉基因株系與WT、EV 對比可得，相同PAR 條件下，B1、B2的Pn值均明顯低于對照組，表明轉基因煙草的光合作用被抑制。

圖9 不同株系的光響應曲線Fig.9 Light response curve of different strains

轉CibHLH1基因株系的最大凈光合速率（maximum net photosynthetic rate，Pmax）、表觀量子效率（apparent photosynthetic quantum yield，AQY）和光飽和點（light saturation point，LSP）較對照組均顯著降低（表2）。與WT相比，轉基因煙草株系（B1、B2）的Pmax分別降低38.04%和39.86%，AQY 值分別下降20.55%和19.63%，LSP 分別下降16.91%和21.80%。與EV 相比，轉基因煙草株系的Pmax分別降低38.56%和40.36%，AQY 值分別下降27.80% 和26.97%，LSP 分別下降10.36% 和15.63%。轉CibHLH1基因株系光補償點（light compensation point，LCP）較對照組顯著升高，分別是WT 和EV 的2.04、1.85 倍和2.52、2.28 倍。

表2 不同株系的光合參數(shù)Table 2 Photosynthetic parameters of different strains

2.9 轉基因煙草光合生理指標的測定

轉基因株系和對照組Ci的變化趨勢基本一致，當PAR 值＜200 μmol·m-2·s-1時，B1、B2、EV 和WT 的Ci均隨PAR 的增加迅速下降；當PAR 值≥200 μmol·m-2·s-1時，Ci值變化趨于平緩，并最終達到穩(wěn)定（圖10）。在PAR 為0 時，Ci值最大，B1、B2的最大值分別為475.80、430.90 μmol·mol-1，WT 和EV 的最大值分別為523.34 和499.72 μmol·mol-1，B1、B2的Ci最大值的平均值（453.35 μmol·mol-1）比WT 減少13.37%，比EV減少9.28%。但當PAR 值≥200 μmol·m-2·s-1，Ci值趨于穩(wěn)定時，B1、B2的Ci最小值的平均值（220.45μmol·mol-1） 較 WT （203.27 μmol·mol-1） 增 加8.45%，較EV（167.47 μmol·mol-1）增加31.64%。

圖10 不同株系的光合指標Fig.10 Photosynthetic index of different strains

當PAR 值＜200 μmol·m-2·s-1時，4 個株系的Tr值均隨PAR 的增加而迅速增長；當PAR 達到200μmol·m-2·s-1后，Tr的上升趨勢變緩，至PAR 為600 μmol·m-2·s-1后趨于穩(wěn)定；但當PAR≥1400 μmol·m-2·s-1時，Tr值開始繼續(xù)上升。B1、B2株系始終比WT、EV 的增速更快，且相同PAR 值時，B1、B2的Tr值始終比對照組高。

當PAR 值＜200 μmol·m-2·s-1時，轉基因株系和對照組的Gs值隨PAR 的增加而迅速增長，且轉基因株系的升高速率更快；當PAR 達到200 μmol·m-2·s-1后，Gs的上升趨勢漸緩，在PAR 值達到400 μmol·m-2·s-1時趨于穩(wěn)定；但當PAR≥1400 μmol·m-2·s-1時，Gs值再一次緩慢上升。過表達煙草株系的Gs值始終明顯高于對照組煙草。B1、B2、WT 和EV 的最大Gs值分別為0.069、0.063、0.055 和0.053 mol·m-2·s-1，轉CibHLH1基因煙草株系的最大Gs值的平均值（0.066 mol·m-2·s-1）比對照組（0.054 mol·m-2·s-1）升高了22.22%。

當PAR 值＜200 μmol·m-2·s-1時，轉基因各株系和對照組株系的WUE 呈迅速上升趨勢；當200 μmol·m-2·s-1≤PAR≤1000 μmol·m-2·s-1時，WUE 值基本保持穩(wěn)定；當PAR＞1000 μmol·m-2·s-1時，WUE 值開始緩慢下降。當WUE 值趨于穩(wěn)定后，轉CibHLH1基因煙草株系的WUE 明顯低于WT 和EV。

3 討論與結論

bHLH 家族是最大的轉錄因子家族之一，其廣泛分布在植物、動物和真菌中［32］。Ludwig 等［33］1989 年首次在玉米（Zea mays）中發(fā)現(xiàn)bHLH 轉錄因子，此后，大量的bHLH 蛋白從多種植物中被鑒定出，其中擬南芥中有164 個bHLHs［34］，煙草中有190 個bHLHs［35］，水稻（Oryza sativa）中有180 個bHLHs［36］，葡萄（Vitis vinifera）中有191 個bHLHs［37］，前人研究表明bHLH轉錄因子可以參與植物各種合成代謝和信號轉導過程的調(diào)控，從而影響生長發(fā)育［38-40］。光合作用是植物生長的主要驅動力，bHLH 轉錄因子通過誘導下游相關基因的表達和各種光介導效應參與了這一過程［41］。胡楊（Populus euphratica）PebHLH35在擬南芥中過表達提高了植株的光合速率［42］，大豆GmPIF1過表達可降低葉綠素合成基因和光合作用基因AtHEMA1、AtGUN5和AtPSAE1等的轉錄水平［43］，水稻OsPIL11能激活YGL3的表達，增加凈光合速率及葉綠素合成相關基因的表達量［44］。bHLH 還可調(diào)節(jié)光合色素的合成，影響植物對光能的捕獲能力。擬南芥PIF5［24］，番茄SlPRE3［25］負調(diào)控葉綠素的合成，而草莓FaFIT［45］，白樺（Betula platyphylla）BpbHLH112［46］則對葉綠素的合成起正向調(diào)控作用。本研究從神農(nóng)香菊中克隆了CibHLH1，在煙草中異源轉化研究其在植物光合中的作用。結果發(fā)現(xiàn)，轉基因煙草葉片葉綠素含量顯著降低，在相同PAR 條件下，凈光合速率與野生型相比也顯著降低。表明神農(nóng)香菊CibHLH1可能通過抑制光合色素的合成，降低植物的光合作用，從而減輕高山輻射對葉片的傷害。

當葉片光合機構吸收的光能超過光合作用所能利用的量時，過剩的光能可能引起光合效率和光合功能下降（即光抑制）［47］。高山植物光合機構可通過減少對光能的吸收來減少過剩光能對光合器官的光抑制和光破壞，以適應多變的生存環(huán)境［1］。在高海拔條件下的煙草葉片的葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素的含量均低于低海拔葉片［48］。珠芽蓼（Polygonum viviparum）的葉綠素b、葉綠素（a+b）含量隨生長海拔升高而降低［49］。萌芽期的水蔥（Scirpus tabernaemontani）和茭草（Zizania caduciflora）在移至低海拔地區(qū)后葉綠素含量分別增加了22.54%和11.17%［50］。多年生豆科（Leguminosae）植物的葉綠素含量與牧場的海拔呈負相關［51］。葉綠素含量下降，有利于減少葉片對光的吸收，使其免受強輻射的損傷［52］。CibHLH1過表達煙草葉片明顯黃化，測量顯示葉肉細胞中葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量均顯著降低。葉綠素是植物進行光合作用的基礎，在光合作用中負責捕獲太陽能，葉綠素含量越高，光合能力越強［53］，說明神農(nóng)香菊CibHLH1基因降低了煙草葉片中的光合色素含量，減少對光能的吸收，從而減輕高山環(huán)境的輻射傷害。

影響植物光合速率的因素主要有氣孔限制和非氣孔限制［54］。轉CibHLH1基因煙草的Pn值下降，Gs和Ci值卻都升高，說明影響光合速率的因素是非氣孔限制。氣孔導度和胞間CO2濃度同時升高說明葉片吸收的CO2未被及時用于光合作用，可能是由于葉肉細胞的光合能力受到影響，光合速率下降。Rubisco 是植物光合碳同化關鍵酶［3］，植物的最大凈光合速率決定了Rubisco 的活性［55］，過表達煙草葉片最大凈光合速率降低，表明CibHLH1降低了Rubisco 酶的活性。推測CibHLH1基因負調(diào)控煙草葉片的光合色素合成及碳同化酶活性，降低了煙草對光能的吸收和轉化能力，最終導致凈光合速率顯著降低。表觀量子效率反映了植物對弱光的利用能力［56］。光補償點和光飽和點反映植物對光環(huán)境的適應能力，光補償點越低，表明植物利用弱光的能力越強，光飽和點越高，植物在強光條件下利用轉化光能的能力越強［57］。CibHLH1轉基因煙草的AQY 和LSP 顯著下降，LCP 值顯著升高，且轉基因株系在PAR 為600 μmol·m-2·s-1時相較于對照提前達到光飽和點；可能是因為CibHLH1降低了葉片的葉綠素含量，從而降低煙草在弱光條件下捕獲光能的能力；而在強光條件下，由于Rubisco 酶活性降低，葉片轉化光能的效率降低，可以減輕強光輻射對植株的傷害。

綜上所述，神農(nóng)香菊CibHLH1是葉綠素合成的負調(diào)節(jié)因子，通過降低光合色素的含量，減少植物葉片對光能的吸收，從而造成植物光合能力的減弱，最終使得植物能夠適應高山的強光環(huán)境。