二甲雙胍對(duì)小鼠肝缺血/再灌注損傷中氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用

王新雨，徐俊鵬，王肖婷，劉秀潔，黃慶昊，陳思安，王萬(wàn)鐵

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 缺血/再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035；2.柳州市人民醫(yī)院 急診科，廣西壯族自治區(qū) 柳州 545000；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院（信息與工程學(xué)院），浙江 溫州 325035

肝臟缺血/再灌注損傷（hepatic ischemia/reperfusion injury, HI/RI）是肝切除和肝移植等外科手術(shù)中肝損傷的重要原因，在極端情況下會(huì)發(fā)生全身多器官衰竭，最終導(dǎo)致死亡[1-2]。HI/RI的分子機(jī)制復(fù)雜。有研究指出，氧化應(yīng)激在肝缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）中起著至關(guān)重要的作用，其中涉及多種機(jī)制，包括線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）的開(kāi)放、自噬過(guò)度、免疫應(yīng)答激活等[3]。

研究表明，二甲雙胍對(duì)許多種器官I(mǎi)/R有保護(hù)作用。二甲雙胍通過(guò)降低氧化應(yīng)激，減輕細(xì)胞線粒體損傷來(lái)保護(hù)心臟免受I/R損傷[4]。在腦I/R中二甲雙胍也同樣能通過(guò)促進(jìn)腦神經(jīng)元細(xì)胞存活，改善血腦屏障破壞等發(fā)揮保護(hù)作用[5]。然而目前二甲雙胍與HI/RI的相關(guān)研究較少。由于二甲雙胍通常通過(guò)口服途徑給藥，并且二甲雙胍到達(dá)肝臟的濃度高于其他外周器官或組織[6]，所以本研究選用了C57BL/6小鼠在體HI/RI模型，觀察口服二甲雙胍治療對(duì)肝的保護(hù)效果，探究二甲雙胍減輕HI/RI的具體分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)雄性C67BL/6小鼠15只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)于恒溫和恒濕的條件下，晝夜循環(huán)12 h，并自由獲得食物和水。實(shí)驗(yàn)前，小鼠禁食過(guò)夜。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)： SYXK（浙）2020-0014。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

ALT、AST、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；HE染色試劑盒和PAS染色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。DHE染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成3組，每組5 只：①對(duì)照組（Control組）：術(shù)前給予正常飲水1 周，術(shù)中僅暴露肝臟，但不進(jìn)行血流阻斷和再灌注；②HI/RI組：術(shù)前給予正常飲水1周，再進(jìn)行小鼠肝I/R手術(shù)；③HI/RI+二甲雙胍組（MET組）：術(shù)前給予二甲雙胍 （1 mg/mL）飲水1周，其他操作步驟與HI/RI組相同。

1.4 HI/RI小鼠模型

小鼠短暫地用戊巴比妥鈉麻醉。無(wú)創(chuàng)微血管動(dòng)脈夾置于肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈左支30 min，取下動(dòng)脈夾再灌注6 h。在研究期間，體溫在電熱毯下保持在37 ℃。

1.5 HE組織切片染色

將肝組織固定在4%中性甲醛中，然后進(jìn)行石蠟包埋。5 μm厚的切片用蘇木精和伊紅染色。

1.6 PAS染色

用乙醇對(duì)干燥的涂片進(jìn)行固定，10 min后，沖洗，干燥；用高碘酸鉀對(duì)上一步處理好的涂片進(jìn)行充分氧化，沖洗，再次干燥，然后將涂片放在25 ℃雪夫染液中進(jìn)行染色；之后用配置好的亞硫酸沖刷涂片3次，再次對(duì)涂片水洗，進(jìn)行干燥，之后用甲綠染色，最后用水清洗、干燥，進(jìn)行鏡檢。

1.7 血清ALT、AST檢測(cè)

將5 μL待測(cè)血清和20 μL基質(zhì)液加入96孔版中作為測(cè)定孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，只加入20 μL基質(zhì)液，之后進(jìn)行震蕩，恒溫孵育30 min后，測(cè)定孔加入 20 μL顯色液，對(duì)照孔加入20 μL顯色液和5 μL待測(cè)樣本，重復(fù)上一步驟進(jìn)行震蕩和37 ℃孵育20 min，最后加入終止液200 μL。完成后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，通過(guò)查詢標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)的活力單位。

1.8 MDA檢測(cè)

將冰凍組織取出，加入定量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行研磨，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)532 nm處的吸光度值，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出MDA的水平。

1.9 GSH檢測(cè)

將組織0.1 g，加入定量0.9%氯化鈉溶液后進(jìn)行研磨，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用分光光度計(jì)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)值412 nm進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出數(shù)值后進(jìn)行曲線繪制和計(jì)算。

1.10 肝臟超氧陰離子水平檢測(cè)

將冷凍肝臟切片（8 μm）置于玻片上，用DHE在37 ℃的黑暗容器中放置0.5 h后，用PBS洗刷3遍并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

用Graghpad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所有計(jì)量資料均為正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采取單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍減輕I/R引發(fā)的肝損傷

肝臟大體形態(tài)觀察顯示，與Control組相比，HI/RI組小鼠肝臟表面較為粗糙，充血，呈暗紅色，彈性變差，肉眼可以看見(jiàn)淤血；與HI/RI組相比，MET組肝臟損傷較輕，表面光滑，顏色接近紅褐色，彈性較好，幾乎看不見(jiàn)淤血。HE染色結(jié)果顯示，Control組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)較為完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞從中央靜脈向外輻射，排列整齊，無(wú)肝細(xì)胞損傷和肝脂肪變性；HI/RI組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，肝細(xì)胞腫脹、紊亂、壞死，并伴有肝細(xì)胞和脂肪變性；MET組僅出現(xiàn)部分肝細(xì)胞腫脹、紊亂、損傷、壞死和脂肪變性。PAS染色后糖原顆粒呈紅色或紫紅色。結(jié)果顯示，與Control相比，HI/RI組的紅色或紫紅色顆粒較少，糖原流失較多；與HI/RI組相比，MET組的紅色或紫紅色顆粒較多，說(shuō)明二甲雙胍能減少肝糖原在肝I/R時(shí)的消耗，減輕了HI/RI。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝組織的大體形態(tài)、HE染色和PAS染色圖（×200）

2.2 二甲雙胍降低了HI/RI中ALT和AST水平

結(jié)果顯示，與Control組相比，HI/RI組血清中ALT和AST的濃度出現(xiàn)了顯著的上升（P＜0.01）；與HI/RI組相比，二甲雙胍可以大幅度降低血清中ALT和AST的含量（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清ALT和AST水平比較

2.3 二甲雙胍抑制了HI/RI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

結(jié)果顯示，與Control組相比，HI/RI組肝臟組織中的MDA含量明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），肝組織GSH含量大幅下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與HI/RI組相比，二甲雙胍顯著降低了肝組織MDA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同時(shí)增加了肝組織GSH含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肝臟組織MDA和GSH水平比較

2.4 二甲雙胍減輕了HI/RI中ROS的累積

DHE染色結(jié)果顯示，與Control相比，HI/RI組ROS陽(yáng)性紅色熒光細(xì)胞數(shù)量明顯增多；與HI/RI組相比，二甲雙胍處理后，ROS陽(yáng)性紅色熒光細(xì)胞數(shù)量減少。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠肝組織DHE染色結(jié)果（×400）

3 討論

HI/RI發(fā)生在肝移植、肝切除和其他肝臟手術(shù)期間，會(huì)損害肝臟功能，術(shù)后死亡率較高、恢復(fù)率較低，是早期組織損傷、器官排斥甚至肝衰竭的重要原因[7-10]。HI/RI病理過(guò)程復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、無(wú)菌性炎癥和細(xì)胞凋亡，并且研究人員還在不斷發(fā)現(xiàn)新的復(fù)雜機(jī)制[7，10]。在HI/RI過(guò)程中，Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活、線粒體損傷以及缺血期間ATP消耗增加導(dǎo)致的大量黃嘌呤和次黃嘌呤促進(jìn)了ROS的產(chǎn)生[11]。ROS不僅會(huì)與細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)合，破壞細(xì)胞器，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡[12]，同時(shí)還產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物，誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[13]。 盡管有多項(xiàng)研究調(diào)查了HI/RI的潛在機(jī)制，但目前其病理生理過(guò)程仍不夠明朗。目前較為公認(rèn)的說(shuō)法是氧化應(yīng)激在HI/RI中起著至關(guān)重要的作用[3]。在HI/RI中氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝損傷的最主要因素之 一[11]。大量的ROS由Kuffer細(xì)胞和線粒體在HI/RI早期產(chǎn)生[11，14]，而內(nèi)源性抗氧化劑GSH在HI/RI期間失活或被去除，導(dǎo)致ROS清除減少[9]。此外，ROS水平升高會(huì)損害大分子和脂質(zhì)并產(chǎn)生MDA[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HI/RI后肝臟中MDA的水平顯著升高，肝臟中GSH水平明顯下降。

二甲雙胍是一種胍類(lèi)衍生物，最初是從植物Galega officinalis（法國(guó)丁香）中提取，近60 多年來(lái)一直被用作人體的降血糖藥物，研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)I/R有明顯的保護(hù)作用[16-17]。更為重要的是，二甲雙胍已被證明是安全的，并且具有很高的成本效益，這為二甲雙胍在器官I(mǎi)/R的進(jìn)一步用藥和機(jī)制研究打下了基礎(chǔ)[18]。①腦I/R：研究表明，二甲雙胍通過(guò)抑制腦I/R中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡而保護(hù)神經(jīng)，同時(shí)還減輕了血腦屏障破壞、線粒體功能障礙 等[19-20]。在腦卒中后用二甲雙胍治療可顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[21]。②心肌I/R：二甲雙胍對(duì)心臟的有益作用已在心力衰竭和非心力衰竭患者中觀察到[22]。二甲雙胍可以減少線粒體損傷和心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮高水平的心臟保護(hù)作用[23-24]。此外，二甲雙胍還可恢復(fù)左心室射血分?jǐn)?shù)，降低心肌梗死面積，增加心肌細(xì)胞活力[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)預(yù)防心肌I/R損傷，AMPK的激活通過(guò)關(guān)閉mPTP促進(jìn)糖酵解并保護(hù)肌細(xì)胞活力，防止mPTP打開(kāi)和線粒體破裂[22，26-27]。這種作用是由eNOS磷酸化增加介導(dǎo)的，從而產(chǎn)生一氧化氮。這一證據(jù)表明，二甲雙胍是通過(guò)AMPK-eNOS信號(hào)保護(hù)免心臟受I/R的影響[26-27]。此外，在心臟I/R中還觀察到二甲雙胍通過(guò)恢復(fù)PGC-1α水平和減輕線粒體損傷來(lái)減少缺血后的心肌損傷[26]。③肝I/R：二甲雙胍通過(guò)可以調(diào)節(jié)TIGAR抑制糖酵解，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，抑制肝臟炎癥因子表達(dá)和釋放，從而有效減輕I/R引起的肝損傷[28]。在本研究中，通過(guò)大體形態(tài)及染色觀察，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)HI/RI具有保護(hù)作用，這與之前二甲雙胍對(duì)I/R具有保護(hù)作用的研究結(jié)果一致。此外，又有新的證據(jù)表明二甲雙胍除了減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及抗炎效用外[29-30]，還可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)器官I(mǎi)/R損傷實(shí)現(xiàn)保護(hù)作 用[31]。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療減輕了HI/RI的氧化應(yīng)激，顯著降低了MDA水平，GSH水平也顯著升高，ROS累積顯著減少。

綜上所述，二甲雙胍在減輕HI/RI中起著重要的作用，有著較好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕了HI/RI。這為今后二甲雙胍在HI/RI中的進(jìn)一步機(jī)制探討打下了基礎(chǔ)。