提高m6A去甲基化酶FTO表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖

廖鎮(zhèn)城，楊思懿，吳平安*

1.香港大學(xué)深圳醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 深圳 518000；2.深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518000

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是鼻咽部的惡性上皮性腫瘤,多見于東南亞,具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移的特性。中國(guó)發(fā)病地域差異大,主要分布于廣東、福建、香港等地,在華南、東南亞等流行地區(qū)發(fā)病率高達(dá)30/10萬[1]。表觀遺傳修飾是指基因功能發(fā)生可逆和可遺傳的改變,而不改變基因組DNA序列,如DNA甲基化、RNA甲基化和組蛋白乙?；?。研究表明,表觀遺傳調(diào)控在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育、分化和疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。N6甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是 mRNA 序列中最普遍和最常出現(xiàn)的表觀修飾之一,這是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的修飾過程[2]。該過程由 METTL3、METTL14 和 WTAP 組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化,也可被稱為“解碼器”的去甲基化酶 人類脂肪和肥胖相關(guān)(fat mass and obesity-associated,FTO)蛋白和 ALKBH5“擦除”[3]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和表觀遺傳學(xué)研究的深入,m6A甲基化在各種生物進(jìn)程中的作用引起了廣泛關(guān)注, m6A的研究逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域最大的前沿研究熱點(diǎn)之一。大量研究表明,m6A通過調(diào)控mRNA剪接、穩(wěn)定性、翻譯效率等調(diào)控基因表達(dá),調(diào)控microRNA加工等途徑,參與DNA損傷修復(fù)、干細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程[3]。

2011年首次發(fā)現(xiàn)FTO具有m6A去甲基化酶的活性[4],使m6A修飾成為類似于DNA甲基化和組蛋白乙酰化的動(dòng)態(tài)可逆修飾過程。研究表明,FTO有助于癌干細(xì)胞的自我更新和免疫逃逸,也證明了FTO在靶向治療方面的潛力[5]。 有研究[6]發(fā)現(xiàn)FTO在人乳腺癌中上調(diào),與乳腺癌患者較低的生存率顯著相關(guān);在腎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 FTO 與腫瘤抑制因子VHL(Von Hippel-Lindau) 之間具有相互影響合成,致細(xì)胞死亡的作用[5]; 而m6A可提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療和放療的抵抗能力[7]。另有研究表明m6A去甲基化酶FTO在癌的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[8]。迄今關(guān)于m6A在鼻咽癌中的研究少之又少,尚未見有去甲基化酶FTO對(duì)鼻咽癌發(fā)生,發(fā)展中的作用的研究。本研究假設(shè)m6A去甲基化酶FTO在鼻咽癌的發(fā)生,發(fā)展中具有重要作用。本研究以期通過組織水平,蛋白水平,分子水平去驗(yàn)證假設(shè),發(fā)現(xiàn)去甲基化酶FTO在鼻咽癌中的表達(dá)水平低于癌旁組織?；诖诉M(jìn)行了生物功能實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探究FTO在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用,希冀能找到鼻咽癌治療的新方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本:鼻咽癌及癌旁組織標(biāo)本(中國(guó)深圳 香港大學(xué)深圳醫(yī)院),所有樣本均采集自 2019年至2021年就診的患者,共82例,男性 47 例,女性 25例。標(biāo)本入組條件:患者臨床診斷為鼻咽癌,且未接受過任何化療或放療。所有患者均知曉標(biāo)本的去向和目的,并簽署知情同意書。香港大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批件號(hào):倫[2019]101。

1.1.2 細(xì)胞系與小鼠:人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1、CNE-2、5-8F來源于鼻咽癌(香港大學(xué)深圳醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室);人鼻咽癌細(xì)胞系C666-1和人永生化鼻咽癌細(xì)胞系NP69(上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù));OE(僅代表5-8F過表達(dá)株) 來源于鼻咽癌(香港大學(xué)深圳醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室);6周齡雄性裸鼠(中國(guó)深圳 拓?fù)渖锟萍?。

1.1.3 試劑盒:10%胎牛血清、 RPMI-1640和補(bǔ)充有牛垂體提取物的角質(zhì)形成細(xì)胞/無血清培養(yǎng)基(Gibco公司);過表達(dá)慢病毒(中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司);TRIzol試劑(Invitrogen公司);一抗FTO兔單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);NovoScript Plus ALL-in-one1st Strand cDNA Synthesis Supermix (gDNA Purge) 試劑盒(Novoprotein公司);QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen公司);ECL 試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):所有細(xì)胞系均在于37 ℃恒溫,含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),達(dá)到對(duì)數(shù)增殖期時(shí)收集。

1.2.2 構(gòu)建質(zhì)粒和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:通過中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因購(gòu)買FTO過表達(dá)載體,該過表達(dá)載體將完整的人FTO(NM-001363894)基因置于GV492載體中,以無FTO序列的空載體作為對(duì)照。 將合成的人FTO基因連接到過表達(dá)載體GV492(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)上。重組慢病毒感染鼻咽癌細(xì)胞5-8F,用嘌呤霉素(2 μg/mL)篩選出穩(wěn)定表達(dá)成功的細(xì)胞株5-8F 0E。 所有轉(zhuǎn)染步驟均按照說明書進(jìn)行。RT-qPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡分別驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中mRNA和FTO蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中mRNA水平:使用 TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總 RNA,在-80 ℃的無RNA酶水中儲(chǔ)存。對(duì)于RT-qPCR,使用NovoScript Plus ALL-in-one1st Strand cDNA Synthesis Supermix (gDNA Purge) (oncoprotein)試劑盒將總RNA合成第1鏈cDNA。核糖體蛋白S18的mRNA含量作為內(nèi)部參照。FTO的引物序列為:正鏈5′-ACTTG GCTCCTTATCTGACC-3′,反鏈 5′-TGGTGCAGTGT GAGAAAGGCTT-3′。使用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。 反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán)。 所有實(shí)驗(yàn)均運(yùn)行3遍。 使用2-ΔΔCt方法計(jì)算FTO的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)鼻咽癌組織及癌旁組織中FTO蛋白:用4%多聚甲醛固定組織,經(jīng)過石蠟包埋,切片,切片機(jī)切成4 μm切片,將載玻片加熱至72 ℃,加入150 μL Dond dewax solution,孵育30 min,用酒精沖洗1次并用 Bond wash solution 洗滌1次,加入150 μL BOND epitope retrieval solution2,在100 ℃ 下孵育20 min,然后再次使用150 μL Dond dewax solution沖洗載玻片。打蠟3 min。室溫孵育 150 μL 1抗 FTO(1∶1 000 稀釋度;Proteintech),用 150 μL Dond wash solution 洗滌 3 次,室溫孵育150 μL一抗 8 min,150 μL Dond wash solution洗3次,每次2 min。加入15 mL辣根過氧化物酶,室溫孵育8 min,用Dond wash solution洗3次,再用去離子水洗1次,加入150 μL peroxide,室溫封閉5 min,用 Dond wash solution沖洗3次,再用去離子水洗1次。 預(yù)先準(zhǔn)備好的 DAB Part1 和 DAB Part B,現(xiàn)場(chǎng)制備mixed DAB refine 150 mL,在室溫下孵育6 min,然后用 Dond wash solution洗滌3次。加入150 μL蘇木精,室溫孵育8 min。最后,在用去離子水沖洗2次,添加 Bond wash溶液以恢復(fù)藍(lán)色。后用乙醇脫水,脫蠟,并用中性膠固定在載玻片上。使用DAB顯示免疫復(fù)合物。最后顯微鏡攝影。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中的FTO蛋白:用 RIPA 裂解緩沖液從細(xì)胞系中提取蛋白質(zhì)并測(cè)定目標(biāo)分子的蛋白質(zhì)水平。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PDVF膜上。在室溫下用5% BSA封閉 1 h后,將膜與一抗孵育常溫過夜。用TBST溶液洗滌膜3次,每次5 min,并與二抗在室溫下孵育1 h。最終使用 ECL 試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化攝影。

1.2.6 軟瓊脂集落增殖實(shí)驗(yàn):將10 000個(gè)FTO轉(zhuǎn)染細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞接種在軟瓊脂平板上(下層瓊脂1.0%,上層瓊脂0.7%)。平板在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中增殖9 d,每 3 d更換1次培養(yǎng)基。在瓊脂上平鋪1層培養(yǎng)基防止干燥[9]。顯微鏡下隨機(jī)觀察拍照,計(jì)數(shù)大于0.1 mm的細(xì)胞集落數(shù)。

1.2.7 體內(nèi)成瘤及增殖實(shí)驗(yàn):共10只6周齡雄性裸鼠分為兩組。隨機(jī)挑選5只小鼠,注射過表達(dá)FTO的鼻咽癌細(xì)胞5-8F OE,其余小鼠作為對(duì)照。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)香港大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。首先,計(jì)數(shù)3×106個(gè)5-8F OE NPC細(xì)胞和5-8F NPC細(xì)胞, 4 ℃冷藏,將不同組的細(xì)胞按組分別注射到小鼠腋前脂肪墊皮下[10]。裸鼠常規(guī)喂養(yǎng)2周,觀察腫瘤形成情況,每3～4 d測(cè)量腫瘤大小,直至最后1 d處死小鼠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NPC組織和NPC細(xì)胞中FTO低表達(dá)

NPC組織中FTO蛋白水平降低(圖1A～C)。鼻咽癌細(xì)胞中FTO蛋白和mRNA水平低于NP69(圖1D,E)。這些結(jié)果均表明 FTO 在鼻咽癌細(xì)胞中低表達(dá)。

A.immunohistochemical picture of adjacent cancer tissue; B.immunohistochemical picture of nasopharyngeal carcinoma tissue; C.quantification of FTO tissue expression in immunohistochemistry; D.Western blot of each nasopharyngeal carcinoma cell line and the human immortalized nasopharyngeal carcinoma cell line NP69; E.relative expression of FTO mRNA in each nasopharyngeal carcinoma cell line and the human immortalized nasopharyngeal carcinoma cell line NP69;*P<0.05 compared with control group; MOD.mean oplical density.圖1 免疫組化與蛋白質(zhì)印跡顯示FTO的表達(dá)情況Fig 1 Immunohistochemistry and Western blotting showed the expression of n=3)

2.2 過表達(dá)FTO 的5-8F抑制NPC細(xì)胞的增殖

成功構(gòu)建1個(gè)過表達(dá) FTO 的 5-8F 鼻咽癌細(xì)胞系OE,并通過qPCR進(jìn)行驗(yàn)證(圖2A)。軟瓊脂集落形成試驗(yàn)表明FTO過表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖(圖2B,C)。

A. 5-8F was the control group, OE was the over-expression experimental group; QPCR showed that FTO was successfully over-expressed; B,C. soft agar proliferation experiment comparison chart and quantification chart;*P<0.05 compared with control group.圖2 FTO過表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖Fig 2 Over-expression of FTO inhibits the proliferation of n=3)

2.3 FTO在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞增殖

成功建立了小鼠模型,觀察14 d,發(fā)現(xiàn)NPC細(xì)胞的成瘤性良好,過表達(dá)FTO的NPC細(xì)胞(OE組)增殖速度明顯低于對(duì)照組 (5-8F)(圖3A,B)。

A.in vivo tumor formation experiment in mice: comparison of the actual size of tumors taken from two groups of mice; B.comparative quantitative chart of tumor volume between two groups;*P<0.05 compared with control(5-8F) group.圖3 小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)FTO降低了鼻咽癌細(xì)胞的增殖速度Fig 3 Tumorigenesis experiments in mice showed that over-expression of FTO reduced the proliferation rate of nasopharyngeal carcinoma cells in

3 討論

鼻咽癌的病因獨(dú)特而復(fù)雜,其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚。目前公認(rèn)的鼻咽癌高危因素包括EB病毒感染,高鹽高滲的飲食習(xí)慣,遺傳家族病史和某些人類白細(xì)胞抗原Ⅰ類基因型等[11]。當(dāng)前m6A調(diào)節(jié)因子(閱讀器、 書寫器和擦除器)已成為研究熱點(diǎn),其作用體現(xiàn)在多種癌中,包括人類乳腺癌[6]、腎癌[4]、胰腺癌[7]等。作為m6A調(diào)節(jié)因子擦除器之一的去甲基化酶FTO受到越來越多的關(guān)注,并在各種癌均見報(bào)道。研究表明 FTO 水平在肝癌組織和細(xì)胞中上調(diào),FTO的過表達(dá)與肝癌患者個(gè)體的不良預(yù)后相關(guān)[12];也有研究發(fā)現(xiàn)FTO通過對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00022的去甲基化促進(jìn)了體內(nèi)食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤生長(zhǎng)[13];在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中,發(fā)現(xiàn)了FTO通過m6A RNA修飾方式調(diào)節(jié)MALAT/miR-384/MAL2軸促進(jìn)[14]。研究表明FTO通過IGF2BP2介導(dǎo)的m6A修飾抑制載脂蛋白E的表達(dá),并可能通過調(diào)節(jié) IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制甲狀腺乳頭狀癌中的糖酵解代謝,從而消除腫瘤生長(zhǎng)[15]。前人對(duì)FTO的研究表明,FTO在癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,既可以作為抑癌基因,也可作為癌基因發(fā)揮作用。然而,關(guān)于m6A調(diào)節(jié)因子在鼻咽癌中的表達(dá)方式和功能的報(bào)道非常少,關(guān)于去甲基化酶FTO與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究目前尚未見報(bào)道。本研究研究證明了 FTO在鼻咽癌細(xì)胞中低表達(dá),這與組織標(biāo)本的表達(dá)趨勢(shì)是一致的,而過表達(dá)FTO可逆轉(zhuǎn)對(duì)鼻咽癌增殖過程中的促進(jìn)作用,這與報(bào)道在對(duì)于FTO在甲狀腺乳突狀癌中的功能表達(dá)是一致的[15]。而FTO在膀胱癌,食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的表達(dá)及功能卻是相反的,這可能存在細(xì)胞來源,培養(yǎng)壞境,操作偏倚等過程中的誤差。FTO在癌細(xì)胞中表達(dá)的高低和能否作為是調(diào)控癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因,還需要更多的生物學(xué)信息指導(dǎo)及明確其調(diào)空機(jī)制。本研究指出FTO在鼻咽癌細(xì)胞中低表達(dá),并表明FTO具有抑制鼻咽癌的增殖能力,這一點(diǎn)在以往的研究中并未被發(fā)現(xiàn)。因此得出FTO在鼻咽癌中作為一個(gè)抑癌基因,在NPC進(jìn)展過程中抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖,并表明 FTO可能是未來 NPC治療的有希望的靶點(diǎn)。

在本研究中,驗(yàn)證了m6A甲基化酶中擦除器之一的 FTO在NPC低表達(dá),促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的增殖。過表達(dá)FTO逆轉(zhuǎn)了這種作用,抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖。因此本研究得出FTO在NPC中作為一個(gè)抑癌基因,在NPC進(jìn)展過程中抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖,并表明FTO可能是未來NPC治療的有希望的靶點(diǎn)。