馬里苷減輕糖尿病小鼠心肌纖維化

田亞婷，張 芳，張博翔，李 甜

新疆醫科大學 基礎醫學院 組織學胚胎學教研室；新疆地方病分子生物學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以高血糖為特征的一個日益嚴重的慢性代謝性疾病[1]。糖尿病性心肌病(diabetic cardomyopathy,DCM)是繼發于糖尿病的一種特異性心肌病,其獨立于高血壓性、冠狀動脈粥樣硬化性或其他原因所致心臟病[2]。糖尿病心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是糖尿病心肌病晚期的主要病理變化之一,是引起心室重塑的重要原因。心肌中過多的膠原(Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)沉積會降低心臟順應性,從而導致左心室硬度增加和收縮功能受損,最終導致心力衰竭[3]。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是細胞增殖、分化、傷口修復和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)產生研究最多和有效的調節劑之一[4]。相關研究表明,TGF-β1的上調與糖尿病心臟的纖維化有關,高葡萄糖可以增加TGF-β1活性,增加糖尿病大鼠心臟中的間質纖維化和細胞肥大[5]。在正常生理狀態下,心臟中的TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量很低,但在高血糖、氧化應激、炎性反應等因素的刺激之下,體內的TGF-β1及其受體的表達會發生變化,使心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞進行分化,刺激膠原、纖維連接蛋白、蛋白多糖等物質的合成,活化的TGF-β1會進一步使細胞外基質沉積,從而加重心臟的纖維化[6]。

馬里苷(marein)是從兩色金雞菊頭狀花序中分離得到,屬于黃酮類化合物。有抑制糖尿病腎病的腎臟纖維化等作用[7]。經查閱,兒茶類化合物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)可以通過調節TGF-β1通路對心肌纖維化產生影響[8],但馬里苷是否通過調節TGF-β1影響糖尿病心肌纖維化還未見報道。因此,本課題擬采用馬里苷干預糖尿病小鼠,觀察糖尿病小鼠心臟纖維化的改變,從而為馬里苷改善糖尿病心肌纖維化提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:5～6周齡自發性糖尿病SPF級db/db雄性小鼠和相同來源db/m雄性小鼠(江蘇常州卡文思實驗動物有限公司),飼養于新疆醫科大學動物實驗中心SPF級動物飼養室。在飼養小鼠時,所需用品都經過高溫高壓消毒,并且符合國際動物保護的有關準則和規則,合格證號:IACUC-20190226-20。

1.1.2 主要試劑:馬里苷(Extrasynthese公司提供純度99.9%);二甲雙胍(metformin,Met)(MCE公司);基因引物序列(上海生工生物公司合成);兔抗fibronectin、vimentin抗體(Abcam公司);兔抗TGF-β(博奧森生物技術有限公司);兔抗GAPDH抗體(Affinity公司);蛋白質marker(10～180 ku)(Thermo Fisher Scientific公司);Masson染色試劑盒(Solarbio公司);蘇木精染液(Biosharp公司)。

1.1.3 給藥試劑的配置方法:

1)羧甲基纖維素鈉溶液:稱取羧甲基纖維素鈉粉末0.0226 g,置于200 μL蒸餾水中,溶解后渦旋混勻,配成 2.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。

2)馬里苷給藥溶液:稱取25 mg馬里苷加入2.5 mL 2.5%羧甲基纖維素鈉溶液中,配置成10 mg/mL的混懸液,以50 mg/kg標準進行小鼠灌胃給藥。

3)二甲雙胍給藥溶液:稱取0.53 g 二甲雙胍加入8.9 mL 2.5%羧甲基纖維素鈉溶液,以280 mg/kg標準進行小鼠灌胃給藥。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組與藥物干預:10只db/m雄性小鼠為對照組,將30只db/db鼠分成3組:10只db/db組,10只二甲雙胍和10只馬里苷陽性藥干預組。根據前期課題組研究,計算出了二甲雙胍和馬里苷的適宜給藥劑量,二甲雙胍適宜給藥劑量為每日灌胃280 mg/kg,馬里苷適宜給藥劑量為每日灌胃50 mg/kg。

1.2.2 樣本收集:藥物干預8周以后,所有的小鼠禁食12 h,不禁水,過夜,頸脈脫臼處死小鼠。心臟組織標本的收集:處死小鼠后,迅速取出其心臟,用眼科剪將心肌周圍的脂肪組織和結締組織去除,用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,并用吸水紙吸干多余的水分。將心肌組織放在培養皿中,切取長約5 mm、橫截面積約1 mm2的組織塊,用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定,置于1.5 mL干凈的凍存管-80 ℃保存。

1.2.3 HE染色觀察心肌組織形態:用切片機將組織蠟塊切成約5 μm厚度的切片。烤片、 脫蠟、梯度乙醇脫水。蘇木精染色5 min,1%的乙醇溶液中分化5 s,1%氨水水溶液返藍30 s,伊紅染色液1 min,放入80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 s。封片、晾干,觀察并采圖。

1.2.4 Masson染色觀察心肌組織形態:烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水。蘇木精染色5 min。酸性乙醇分化液分化8 s。藍化液返藍、麗春紅品紅染色,弱酸工作液清洗,磷鉬酸溶液洗1.5 min。滴加苯胺藍1 min,用蒸餾水沖洗終止染色,加入弱酸工作液。95%乙醇脫水2 s,無水乙醇分化7 s×3次,二甲苯透明1 min×3次。封片、晾干,觀察并采圖。

1.2.5 免疫組織化學檢測各心肌組織vimentin蛋白的表達水平:烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水。用H2O2除去內源性過氧化物。磷酸鹽緩沖液浸泡5 min×3次。高火煮沸5 min,冷卻。血清37 ℃溫箱封閉。一抗覆蓋組織并放入4 ℃冰箱,過夜。 次日取出放置于室溫,用磷酸鹽緩沖液浸泡。二抗覆蓋組織,室溫孵育。磷酸鹽緩沖液浸泡。 DAB顯色、蘇木精染色,乙醇溶液中浸泡2 s,磷酸鹽緩沖液反藍、脫水、透明、封片、觀察并采圖。

1.2.6 Western blot檢測心肌組織纖連蛋白1(fibronectin 1,FN1)、vimentin和TGF-β1蛋白的相對表達:取出在-80 ℃冰箱中保存的心肌組織,加入組織高效蛋白裂解液,在冰上放置30 min,勻漿、裂解并離心,取出上清液,丟棄沉淀,并將其放在冰上進行短期保存,或者將其放在-80 ℃的冰箱中進行長期保存。采用BCA法進行蛋白定量,進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉、敷一抗過夜。第2天,TBST沖洗、敷二抗、曝光、顯影,進行數據分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HE染色觀察小鼠的心肌組織形態學改變

db/m組心肌組織結構清晰,細胞間質未增大,炎性細胞浸潤不明顯;db/db組心肌組織出現了明顯的損害,心肌纖維肥大、腫脹、排列紊亂,部分心肌纖維斷裂,細胞間質明顯腫大,局部有炎性細胞浸潤等現象;二甲雙胍和馬里苷組,心肌結構損傷有所改善,說明馬里苷對心肌纖維化具有一定的保護作用(圖1)。

圖1 各組小鼠心肌組織HE染色結果Fig 1 HE staining results of myocardial tissue in each group

2.2 Masson染色觀察小鼠心肌組織的纖維組織改變

在 db/db組心肌組織中,膠原纖維的含量較 db/m組顯著增加(P<0.01);二甲雙胍和馬里苷組心肌組織膠原纖維表達明顯減少(P<0.01)(圖2)。

Met.metformin; *P<0.01 compared with db/m; #P<0.01 compared with db/db.圖2 各組小鼠心肌組織Masson染色結果Fig 2 Masson staining of myocardial tissues of mice in each n=6)

2.3 免疫組織化學檢測小鼠心肌組織vimentin的表達

與 db/m組相比, db/db組小鼠心肌細胞質內有更多的黃色區域;與db/db組相比較,二甲雙胍和馬里苷組心肌胞質中黃色區域減少(P<0.01)(圖3)。

2.4 馬里苷對心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表達的影響

相對于db/m組,db/db組心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表達明顯增加(P<0.01),二甲雙胍和馬里苷組心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1表達明顯降低(P<0.01)(圖4)。

FN.fibronectin; Met.metformin; *P<0.01 compared with db/m; #P<0.01 compared with db/db.圖4 各組小鼠心肌組織FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表達Fig 4 Expressions of FN1, vimentin and TGF-β1 protein in myocardial tissue of mice in each n=6)

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病發展到終末期的一種嚴重的并發癥,是致糖尿病患者高病死率嚴重的并發癥[9]。在晚期高血糖會引起心肌結構改變,心肌細胞壞死、心肌細胞間質或血管周圍纖維化、心肌肥大等現象[10]。有大量證據表明,糖尿病心肌病晚期的主要病理變化之一就是糖尿病心肌纖維化[11],但其機制仍不清楚。

前期研究結果證明,馬里苷可以使糖尿病小鼠血清胰島素、總膽固醇、三酰甘油有所降低,也具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤等多種生物學效應,以及預防高糖改善胰島素抵抗活性、抑制糖尿病腎病的纖維化的作用[12]。但馬里苷對糖尿病性心肌病的纖維化的作用尚不清楚。

TGF-β1是組織損傷后誘導這些膠原蛋白質所需的細胞因子。大量實驗表明,用TGF-β1刺激心肌成纖維細胞可轉換為肌成纖維細胞,并且使細胞外基質(ECM)過度沉淀、Ⅰ型、Ⅲ型膠原過量合成,引起心肌纖維化。TGF-β1通過跨膜受體絲氨酸/蘇氨酸激酶激活Smads,連續調節靶基因的轉錄[13]。根據本實驗研究可說明TGF-β1與糖尿病心肌纖維化具有密切聯系,且馬里苷對糖尿病心肌纖維化具有一定保護作用。

在糖尿病心肌病中,成纖維細胞可能產生具有纖維化特性的特殊基質蛋白如纖維黏連蛋白(FN),FN1為FN其中的一個亞型。FN1在高血糖的情況下是細胞外基質的積累成分,FN的聚合緊密調節不同ECM蛋白的組裝,包括I型膠原蛋白[14]。Vimentin是一種常用的細胞標志物,它以很高的靈敏度標記成纖維細胞。為了表征成纖維細胞來源的細胞,通常使用vimentin[15]。FN1和vimentin蛋白在心肌中有較高的表達,當心肌發生纖維化時表達會明顯上升。研究表明馬里苷可以降低糖尿病db/db小鼠心肌組織FN1、vimentin、TGF-β1的表達,改善心肌結構的損傷以及心肌組織膠原纖維的沉積,馬里苷對糖尿病db/db小鼠心肌纖維化具有保護作用,具有一定的應用價值,具體機制有待進一步研究。