miR-142-3p通過調控Hmgb1抑制雨蛙素誘導的大鼠胰腺外分泌細胞系AR42J凋亡

蘇拾香，王語陽，覃宗帥，黃桂香，徐 鍵，岑蘭英，覃月秋*

1.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000；2.右江民族學院 研究生院，廣西 百色 533000

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床常見的消化系統疾病,以嚴重炎性反應和腺泡細胞死亡為特征,該病起病急,進展快,部分可發展為重癥急性胰腺炎,病死率高且預后差[1]。急性胰腺炎的發生發展和細胞凋亡密切相關[2],而微RNA(microRNA,miRNA)可通過直接調控其靶基因影響細胞凋亡,參與急性胰腺炎的發生和發展[3]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)可以通過調控細胞凋亡而參與胰腺損傷、炎性反應、腫瘤的發生發展過程[4]。研究發現,miR-142-3p靶向Hmgb1在一些疾病中調控細胞凋亡[5],但在急性胰腺炎中尚未見文獻報道。本研究采用大鼠胰腺外分泌細胞AR42J細胞構建AP模型,以研究miR-142-3p靶向Hmgb1調控腺泡細胞凋亡的影響及機制,為治療AP提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

大鼠胰腺外分泌細胞系AR42J和Ham′s F-12K培養基(上海澳睿賽生物技術有限公司);PBS、多聚賴氨酸、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司);青-鏈霉素混合液、20×TBST、蛋白磷酸化酶抑制、PMSF、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司);雨蛙素(cerulein,純度≥95.0%,上海源葉生物科技有限公司);細胞凋亡-Hoechst 33258染色試劑盒、QuickBlockWestern快速封閉液、彩虹 Marker (上海碧云天生物技術有限公司);RIPA裂解液(北京英文特生物技術有限公司);Caspase-3、β-actin、山羊抗兔免疫球蛋白(H+L)HRP、山羊抗小鼠 IgG(H+L)HRP (江蘇親科生物研究中心有限公司);Bax、HMGB1抗體(Abcam公司);質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司);Bcl-2、10×SDS-PAGE 電泳緩沖液、10×Tris-Glycine 轉膜緩沖液、PAGE 凝膠快速制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司);Trizol、 Lipofectamine3000(上海賽默飛世爾科技有限公司);PVDF 膜(Millpore公司);超敏 ECL 化學發光試劑盒(蘇州莫納生物科技有限公司);Opti-MEM (Gibco公司);MicroRNA第一鏈cDNA反轉錄試劑盒、SYBR Master Mix擴增試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);RT-qPCR 引物(廣州易錦生物技術有限公司);AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:將AR42J細胞分為空白組(blank),急性胰腺炎細胞模型組[6](AP,100 nmol/L雨蛙素作用24 h),造模24 h后細胞胞質內出現大量空泡。再分別用miR-142-3p mimics、 mimics NC、miR-142-3p inhibitor 和inhibitor NC轉染模型組細胞6～8 h,記為miR-142-3p mimics組、 mimics NC組、miR-142-3p inhibitor組 和inhibitor NC組,繼續培養24、48 h后用于試驗檢測。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-142-3p表達:轉染24 h后各組細胞加入1mL Trizol試劑提取細胞RNA,利用miRNA第一鏈cDNA反轉錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR反應條件為:預變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 10 s, 退火56 ℃ 10 s,延伸72 ℃ 30 s,40個循環。以U6作為 miR-142-3p的內參,結果使用2-ΔΔCt法分析。各基因引物序列見表1。

1.2.3 Western blot檢測HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白:轉染48 h后收集各組細胞,用RIPA裂解液裂解細胞,收集上清液,用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE分離條件為80 V 30 min,120 V 70 min,常規濕法轉膜后,快速封閉液封閉45 min, 各組分別加入各兔抗人HMGB1抗體(1∶1 000)、兔抗人 caspase-3抗體(1∶1 000)、鼠抗人 Bcl-2 抗體(1∶1 000)、兔抗人β-actin 抗體(1∶5 000) 4 ℃搖床孵育過夜,洗滌,IgG-HRP標記的羊抗兔 IgG-HRP(1∶5 000)、羊抗鼠 IgG-HRP(1∶5 000)二抗室溫搖床孵育2 h,洗滌, ECL顯影。蛋白質條帶使用Image J軟件分析吸光度值。

1.2.4 Hoechst染色測定細胞凋亡:各組細胞接種于6孔板內,使其約為50%～80%匯合度。刺激細胞發生凋亡后,吸盡培養液,加入0.5 mL固定液,固定10 min或更長時間(可4℃過夜)。去固定液,用PBS洗滌。加入0.5mL Hoechst 33258染色液染色。去染色液,用PBS洗滌。滴抗熒光淬滅封片液。熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細胞測量術測定各組細胞凋亡率:轉染后24 h,制備各組重懸細胞,各組細胞按照annexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作,流式細胞儀上機檢測。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶向關系:構建Hmgb13′UTR-WT和Hmgb13′UTR-MUT的熒光素酶報告載體,分別與miR-142-3p mimics、miR-142-3p mimics NC共轉染,按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作,轉染48 h后收集細胞,比較各組相對熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞培養及轉染

常規培養的AR42J細胞呈上皮細胞樣,貼壁增殖,細胞增殖速度緩慢,有密度依賴,成片增殖(圖1A)。雨蛙素刺激造模24 h后,細胞胞質內出現大量空泡,部分細胞變形,偽足增多(圖1B)。轉染后細胞松散,形態較圓,部分細胞可見脫落死亡(圖1C)。

A.normal AR42J cells; B.24 hours after cerulein stimulation,vacuoles appeared in the cytoplasm, cell deformation, pseudopodia increased(white arrow);C.24 hours after transfection,cells were loose and round in shape, and some cells fell off and died(white arrow)圖1 AR42J細胞培養和轉染效果Fig 1 Cell culture and transfection effect for AR42J cells(×200)

2.2 各組細胞miR-142-3p的表達

與空白組相比,AP組的miR-142-3p表達水平顯著下調(P<0.01);與mimics NC組相比,miR-142-3p mimics組miR-142-3p表達水平顯著上調(P<0.01);與inhibitor NC組相比,miR-142-3p inhibitor組miR-142-3p表達水平下調(P<0.05)(圖2)。

AP.acute pancreatitis; *P<0.05,**P<0.01 compared with blank or NC.圖2 各組細胞miR-142-3p相對表達量Fig 2 Relative expression of miR-142-3p in each

2.3 各組細胞HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達

與空白組相比,AP組的HMGB1、caspase-3蛋白表達量上調(P<0.05)(圖3A～B),Bax蛋白表達量顯著上調(P<0.01)(圖3C),Bcl-2蛋白表達量顯著降低 (P<0.01)(圖3D)。與mimics NC組相比,miR-142-3p mimics組HMGB、caspase-3、Bax蛋白表達量顯著下調(P<0.01)(圖3A～C),Bcl-2蛋白表達量上調(P<0.05)(圖3D)。與inhibitor NC組相比,miR-142-3p inhibitor組HMGB1、caspase-3、Bax 蛋白表達量顯著上調(P<0.01)(圖3A～C),Bcl-2 蛋白表達量降低(P<0.05)(圖3D)。

A.relative expression of HMGB1 protein in each group; B.relative expression of caspase-3 protein in each group; C.relative expression of Bax protein in each group; D.relative expression of Bcl-2 protein in each group;*P<0.05,**P<0.01 compared with blank or NC group; AP.acute pancreatitis.圖3 各組細胞HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達情況Fig 3 Expression of HMGB1, caspase-3, Bax and Bcl-2 protein in each

2.4 各組細胞凋亡情況

空白組正常細胞的細胞核呈正常的藍色(圖4A),與空白組相比,AP組細胞的細胞核呈致密濃染,部分顏色發白(圖4B);與mimics NC對照組相比,miR-142-3p mimics組細胞核致密濃染較少(圖4D);與inhibitor NC組相比轉染miR-142-3p inhibitor后細胞核致密濃染增多(圖4F)。二維散點圖記錄AR42J細胞凋亡, annexinV-APC為橫坐標, 7-AAD為縱坐標, 以陰性對照設定正常界限, 將細胞分為: 正常活細胞(左下象限Q1-LL,annexinV-APC-、7-AAD-); 早期凋亡細胞(右下象限Q1-LR,annexin V-APC+、7-AAD-); 晚期凋亡和死亡細胞(右上象限Q1-UR,annexin V-APC+、7-AAD+)。與空白組相比,AP組早期凋亡細胞增多,凋亡率顯著升高(P<0.01)(圖5B);與mimics NC對照組相比,miR-142-3p mimics組早期細胞凋亡減少,凋亡率顯著降低(P<0.01)(圖5D);與inhibitor NC組相比,miR-142-3p inhibitor組早期細胞凋亡增多,凋亡率顯著升高(P<0.01)(圖5F)。

AP.acute pancreatitis;*P<0.01 compared with blank or NC.圖5 流式細胞測量術檢測各組AR42J細胞凋亡水平Fig 5 Level of apoptosis in each group of AR42J cells was detected by flow

2.5 miR-142-3p靶向調控Hmgb1的表達

Target Scan Human數據庫顯示HMGB1與hsa-miR-142-3p存在結合位點(圖6)。為了進一步驗證Hmgb1與miR-142-3p之間的互作關系,進行熒光素酶報告基因檢測,實驗結果顯示Hmgb1與rno-miR-142-3p含有互補的核苷酸序列(圖7);與轉染miR-142-3p mimics NC+rno-Hmgb1-3′UTR-wt 相比,共轉染rno-miR-142-3p mimics+rno-Hmgb1-3′UTR-wt的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)。由此可見,miR-142-3p可靶向調控Hmgb1的表達(圖8)。

圖6 Target Scan Human數據庫顯示HMGB1與miR-142-3p的互作靶點Fig 6 Target Scan Human database shows the interaction target of HMGB1 and miR-142-3p

圖7 Rno-miR-142-3p與r-Hmgb1-3′UTR靶位點結合示意圖Fig 7 Binding of rno-miR-142-3p to rno-Hmgb1-3′UTR target site

3 討論

急性胰腺炎是臨床常見的消化系統疾病, 起病急,進展快, 大多數患者表現為輕癥急性胰腺炎,呈自限性,但仍有20%發展為重癥急性胰腺炎[7]。近來研究發現細胞凋亡與AP的發生、發展密切相關[2],在輕癥急性胰腺炎中存在廣泛的腺泡細胞凋亡,但在重癥急性胰腺炎中則以腺泡細胞壞死為主[8]。

HGMB1通常作為損傷相關模式分子,是炎性反應、免疫和代謝反應的介質[9],近年研究發現HGMB1可通過調控細胞凋亡而參與胰腺損傷、炎性反應和腫瘤的發生發展過程[4]。經雨蛙素誘導的急性胰腺炎小鼠模型、AR42J細胞炎性模型中,HGMB1、caspase-3、Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低[10-11]。急性胰腺炎患者血清中caspase-3水平升高[12]。本研究發現,與空白組相比,模型組HGMB1、caspase-3、Bax蛋白表達量升高,Bcl-2蛋白表達量下降,這與文獻報道一致。

miR-142-3p作為一類小非編碼RNA,在機體生理和病理過程中發揮著關鍵的調節作用[13]。研究發現,miR-142 模擬物靶向 TLR4/NF-kB 信號通路,促進Bcl-2表達,抑制caspase-3和Bax表達,從而抑制新生大鼠心肌細胞凋亡,保護小鼠心臟組織免受缺血/再灌注的侵害,從而改善心臟功能[14]。在實驗性骨關節炎小鼠的關節軟骨組織中,miR-142-3p表達水平下降,miR-142-3p的過表達靶向Hmgb1介導的 NF-kB 信號通路來抑制軟骨細胞凋亡[15]。

上述研究表明,miR-142-3p與細胞凋亡及疾病進展密切相關,但是否靶向Hmgb1調控雨蛙素誘導的大鼠外分泌系細胞AR42J的凋亡尚不明確。本研究發現在AP組中miR-142-3p低表達,HGMB1、caspase-3、Bax表達上調,Bcl-2表達下調,細胞凋亡水平升高。上調miR-142-3p表達后,HGMB1、caspase-3、Bax表達下調,Bcl-2表達上調,細胞凋亡水平下降;而下調miR-142-3p表達可逆轉上述結果。提示miR-142-3p可能通過HGMB1調控凋亡相關蛋白 caspase-3、Bax和Bcl-2的表達來調控急性胰腺炎AR42J細胞的凋亡。為明確miR-142-3p與Hmgb1靶向關系,本研究進行雙熒光素酶基因實驗,結果證實Hmgb1為miR-142-3p的靶基因。

綜上所述,miR-142-3p通過靶向Hmgb1調控凋亡相關蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2的表達水平,進而影響雨蛙素誘導的大鼠胰腺外分泌細胞系AR42J的凋亡,這為臨床治療AP提供新思路。