miR-139-5p增強二甲雙胍抑制正常糖培養下人胰腺癌細胞系PANC-1增殖

余 潔，馬明磊，張化冰，平 凡，李 偉，許嶺翎，李玉秀*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 內分泌科 國家衛生健康委員會內分泌重點實驗室，北京 100730；2.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 內分泌科，北京 100038

胰腺癌(pancreatic cancer)是一種高度惡性的腫瘤,90%的患者在被發現時已經發生了轉移。轉移主要發生在胰周和腹腔臟器,導致中晚期病情較為嚴重,預后非常不好[1]。

據流行病學研究顯示,與非糖尿病患者相比,糖尿病患者的腫瘤發生更為普遍[2]。在糖尿病或糖尿病前期人群中,患胰腺癌的相對風險在1.6至2.8之間[3]。一項薈萃分析表明,空腹血糖每升高0.56 mmol/L,患胰腺癌的風險就會增加14%[4]。 二甲雙胍(metformin,Met)作為一種降糖藥物,近年來越來越多的研究證明它還具有抗腫瘤的潛能[5],然而,不同的葡萄糖水平是否會影響其抗腫瘤作用,結論尚不統一。此外,研究發現二甲雙胍可能通過調控微RNAs(microRNAs,miRNAs)表達抑制胰腺癌細胞增殖[6],而一些研究發現miR-139-5p具有抑制細胞增殖的作用[7]。但是,二甲雙胍的抗腫瘤作用是否與miR-139-5p相關目前尚無研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:人胰腺癌細胞系PANC-1(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)。

1.1.2 試劑(盒):EdU細胞增殖檢測試劑盒、TUNEL試劑盒、DAPI染色液(廣州銳博生物技術有限公司);反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Qiagen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養細胞:將細胞置于含有25 mmol/L葡萄糖[高糖(high-glucose,HG)組]或5 mmol/L葡萄糖[正常糖(normal-glucose,NG)組]+10%胎牛血清的DMEM培養基中,并在含有5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養。分別加入不同濃度的二甲雙胍(0、5、10、20 mmol/L)處理細胞48 h,對細胞的增殖、凋亡、遷移及細胞周期進行檢測。重復樣本數n=3。

1.2.2 轉染siRNA:使用LipofectamineTM3000對細胞進行miR-139-5p模擬物和陰性對照轉染。

1.2.3 EdU法檢測細胞增殖:取對數生長期的PANC-1細胞,以5×107個/L細胞的濃度接種于96孔板中。24 h后,分別加入不同濃度的二甲雙胍(0、5、10、20 mmol/L)處理細胞48 h。接著,使用EdU細胞增殖檢測試劑盒來檢測細胞的增殖情況。通過使用Acumen X3細胞儀進行圖像采集,并且用增殖細胞數除以總細胞數計算出細胞增殖率。

1.2.4 TUNEL檢測細胞凋亡:取對數期的PANC-1細胞,以5×107個/L的濃度在96孔板中接種。24 h后,分別加或不加二甲雙胍(0/5/10/20 mmol/L)處理48 h。采用TUNEL試劑盒鑒定凋亡細胞中的DNA片段。用Acumen X3細胞儀進行圖像采集,用凋亡細胞數除以總細胞數計算細胞凋亡率。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移:將對數生長的PANC-1細胞以濃度5×107個/L接種在帶有OrisTM細胞接種限位塞的96孔板(Platypus Technologies)中。利用OrisTM塞子工具謹慎移除硅膠塞子,在板中心創建了一個大約2 mm直徑的無細胞區。經過48 h的二甲雙胍(濃度為0/5/10/20 mmol/L)處理,使用DAPI染色,Acumen X3細胞儀進行檢測。中心的無細胞區域將被從周邊區域遷移過來的細胞所填充,體現細胞的遷移能力。

1.2.6 細胞周期的檢測:將對數期的PANC-1細胞用胰蛋白酶進行消化,調整到濃度為5×107個/L,接種在96孔板中。進行二甲雙胍處理(濃度分別為0/5/10/20 mmol/L),持續48 h。使用DAPI染色法來檢測細胞的周期,并通過Acumen X3細胞儀來分析并計算出處于各個細胞周期的細胞的比例。

1.2.7 RT-qPCR定量檢測miR-139-5p的表達:使用反轉錄試劑盒進行cDNA合成,利用熒光定量PCR試劑盒進行RT-qPCR檢測。選擇小RNAU6作為內參,引物序列如下:miR-139-5p(forward primer):5′-AATAGTAGCCCCTGCCCACC-3′,U6(forward primer):5′-AATAGTAGCCCCTGCCCACC-3′。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 二甲雙胍可抑制PANC-1細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制細胞遷移,誘導S期和G2/M期阻滯

PANC-1細胞在NG和HG培養環境下,5 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍均能抑制其生長(P<0.05)(圖1A),10 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍均能促進其凋亡(P<0.01)(圖1B),這種作用在NG培養條件下更為顯著,高劑量的二甲雙胍(10或20 mmol/L)幾乎能完全抑制PANC-1細胞的生長,并能導致80%～95%的細胞凋亡(P<0.001)(圖1D～E,G)。然而,僅在HG培養條件下中,10 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍可抑制PANC-1細胞的遷移(P<0.05)(圖1C,H)。

A,B.cell proliferation;C,D.cell apoptosis;E,F.cell migration;G.identification of DNA fragments in apoptosis cells using TUNEL kit;H.cell migration test:Green fluorescence in the central area represented migrating cells, while blue fluorescence in the peripheral area represented non-migrating cells;Met.metformin; NG.normal-glucose; HG.high-glucose group;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Met 0 mmol/L;#P<0.01 compared with HG.圖1 二甲雙胍對人胰腺癌細胞系PANC-1細胞增殖、凋亡、遷移的影響Fig 1 Effects of metformin on proliferation, apoptosis and migration of PANC-1

在HG組中,10 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍能降低G1期細胞的比例,提高S期和G2/M期細胞的比例(P<0.05)(圖2A);在NG組中,5 mmol/L及以上濃度的二甲雙胍能降低G1期細胞的比例,提高S期和G2/M期細胞的比例(P<0.05)(圖2B)。二甲雙胍對PANC-1細胞周期的作用在NG組比HG組更為顯著(P<0.05)(圖2C～F)。

A.effects of metformin on cell cycle in high-glucose(HG) group;B.effects of metformin on cell cycle in normal-glucose(NG) group;C.percentage of G1 phase cells;D.percentage of S phase cells;E. percentage of G2/M phase cells;F.percentage of S+G2/M phase cells;Met.metformin; *P<0.05 compared with Met 0 mmol/L; #P<0.05, ###P<0.001 compared with HG.圖2 二甲雙胍對PANC-1細胞周期的影響Fig 2 Effects of metformin on cell cycle of

2.2 正常糖培養條件下,二甲雙胍干預上調PANC-1細胞中miR-139-5p表達

在無二甲雙胍處理下,高糖組和正常糖組中的miR-139-5p表達量差異無統計學意義。在二甲雙胍處理后,正常糖組中的miR-139-5p表達量上調,高糖組中的變化則無統計學意義,其中5 mmol/L和10 mmol/L的二甲雙胍處理分別使正常糖培養條件下的PANC-1細胞中miR-139-5p表達量增加了0.97倍和0.72倍(圖3A,B)。

A.effects of different concentrations of metformin on the expression of miR-139-5p in PANC-1 cells; B.expression of miR-139-5p in PANC-1 cells under different concentrations of glucose culture conditions; NG:normal-glucose group;HG.high-glucose group;Met.metformin; *P<0.001 compared with Met 0 mmol/L;#P<0.01 compared with HG.圖3 不同葡萄糖培養條件下miR-139-5p在二甲雙胍干預前后的表達差異Fig 3 Expression of miR-139-5p in different glucose culture conditions before and after metformin

2.3 正常糖培養條件下,miR-139-5p可增強二甲雙胍的抗腫瘤作用

在無二甲雙胍干預且處于正常糖培養條件下,相較于NC組,miR-139-5p模擬物組的PANC-1細胞增殖下降,凋亡增加但未達統計學差異,細胞周期無影響。高糖培養條件下,兩組之間的上述指標差異均無統計學意義(圖4A,C;圖5A,C,E)。

A,B.cell proliferation;C,D.cell apoptosis; NC.negative control;Met.metformin;NG.normal-glucose group; HG.high-glucose group; *P<0.05,**P<0.001 compared with NC;#P<0.05,##P<0.001 compared with HG.圖4 miR-139-5p模擬物對高糖或正常糖條件下培養的PANC-1細胞增殖和凋亡的影響Fig 4 Effects of miR-139-5p mimic on proliferation and apoptosis of PANC-1 cells cultured under high or normal glucose

A,B.percentage of G1 phase cells;C,D.percentage of S phase cells;E,F.percentage of G2/M phase cells;NC.negative control;Met. metformin,;NG.normal-glucose group;HG.high-glucose group; *P<0.05 compared with NC; #P<0.001 compared with HG.圖5 miR-139-5p模擬物對高糖和正常糖條件下培養的PANC-1細胞周期的影響Fig 5 Effects of miR-139-5p mimic on the cell cycle of PANC-1 cultured under high and normal glucose

二甲雙胍干預+正常糖培養條件下,miR-139-5p模擬物組與NC組相比,5 mmol/L二甲雙胍抑制增殖作用增強,10 mmol/L二甲雙胍促進凋亡作用增強,10 mmol/L二甲雙胍對細胞S期阻滯的作用減弱(P<0.01),而在高糖組miR-139-5p模擬物對二甲雙胍的作用影響無統計學意義(圖4A,C;圖5A,C,E)。

無論是否存在二甲雙胍的干預,相較于高糖組,miR-139-5p模擬物在正常糖組中對細胞的凋亡誘導作用表現得更為顯著,使正常糖組中的PANC-1細胞具有更低的G1期比例和更高的S期以及G2/M期比例(圖4B,D;5B,D,F)。

3 討論

該研究發現二甲雙胍可以抑制PANC-1細胞的增殖,誘導其凋亡,并促使細胞周期阻滯在S期和G2/M期。在正常糖培養條件下,這些作用更為顯著。另外,只有在正常糖培養條件下,二甲雙胍處理的PANC-1細胞中miR-139-5p的表達增加,miR-139-5p模擬物可增強二甲雙胍的抗腫瘤作用。

既往研究已證實二甲雙胍具有抗腫瘤作用,且在多種腫瘤相關研究中得到證實。然而,關于不同的葡萄糖培養濃度對二甲雙胍作用的影響,研究結論仍不一致。部分研究發現,二甲雙胍僅在正常葡萄糖培養條件下抑制腫瘤細胞增殖[8-9];另一研究則發現,在高葡萄糖培養條件下,二甲雙胍能抑制甲狀腺癌細胞增殖,但在正常葡萄糖培養條件下,二甲雙胍能夠促進甲狀腺癌細胞的凋亡[10],部分支持該研究結果。可能的機制是僅在正常糖培養條件下,二甲雙胍可以誘導內質網應激和自噬[10],并可通過抑制腫瘤細胞產生ATP進而誘導細胞凋亡[11]。此外,該研究發現二甲雙胍僅在正常糖培養條件下誘導PANC-1細胞中miR-139-5p表達上調,且miR-139-5p可增強二甲雙胍的抗腫瘤作用,提示miR-139-5p表達上調可能也是二甲雙胍在正常糖培養條件下抗腫瘤作用更強的重要機制之一。因此,相對較低的血糖水平可能可以提高腫瘤細胞對二甲雙胍抗腫瘤作用的敏感性,提示糖尿病合并胰腺癌患者應積極進行降血糖治療。

其次,既往的研究顯示二甲雙胍可以使某些腫瘤細胞停滯在G0/G1期,但本研究發現,二甲雙胍導致PANC-1細胞停滯在S期和G2/M期,這與之前的一些研究結果不一致[12-13]。這種差異可能與二甲雙胍的干預時長有關,在此前的研究中,二甲雙胍的使用時間從24到72 h不等。另外,吉西他濱是一種通過誘導細胞周期S期阻滯來發揮抗腫瘤作用的藥物[14],被視為胰腺癌的一線化療藥物。體內外的研究顯示,二甲雙胍與吉西他濱聯合可增強吉西他濱單獨使用的效果[15]。因此,二甲雙胍與吉西他濱或其他針對細胞周期S期或G2/M期的藥物聯合使用可能具有協同增強的抗腫瘤效果,有望給患者帶來更多的獲益。

本研究存在一些局限性,包括:1)未通過沉默miR-139-5p來進行反向驗證,以雙向確認其作用;2)未進行有或無糖尿病的腫瘤誘導小鼠實驗。

綜上,在正常糖培養條件下,二甲雙胍抑制PANC-1細胞增殖、誘導凋亡和細胞周期阻滯的作用較高糖培養條件下更顯著,部分可能與上調miR-139-5p有關。未來還需進行更多的基礎與臨床研究進一步證實。