化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)EB VCA 和EB EA IgA 的方法學(xué)性能評(píng)價(jià)

李藹文，王楠，鄧超

廣東省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510095

EB 病毒（epstein-barr virus, EBV）是一種能普遍感染人類且與多種惡性腫瘤發(fā)病有密切關(guān)系的DNA 病毒[1]。EB 病毒編碼多種結(jié)構(gòu)抗原，機(jī)體感染EB 病毒后針對(duì)不同的抗原產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[2]。在鼻咽癌患者的感染早期，EB 病毒衣殼抗原抗體（EB VCA IgA）和EB 病毒早期抗原抗體（EB EAIgA）滴度明顯高于健康攜帶者，檢測(cè)系統(tǒng)在應(yīng)用于臨床之前須對(duì)其性能進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。本研究收集2020 年4—6 月到中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的患者和體檢人群的全血標(biāo)本，共計(jì)40 例。通過(guò)MAGLUMI X8 檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定EB VCA 和EB EA IgA的精密度、敏感性與特異性、方法學(xué)效果比對(duì)、線性范圍和參考區(qū)間，以驗(yàn)證廠商給定的性能參數(shù)，為臨床用于鼻咽癌的早期篩查提供快速、準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集本院就診的患者和體檢人群的全血標(biāo)本，分為即鼻咽癌（nasopharyngeal cancer, NPC）組（經(jīng)病理診斷確診的鼻咽癌患者20 例）和健康對(duì)照組（healthycontrol, HC）（健康體檢人群20 例），共計(jì)40例樣本。其中鼻咽癌組中男10 例，女10 例；年齡20～55 歲，平均（33.21±2.44）歲。健康對(duì)照組中男9例，女11 例；年齡20～54 歲，平均（33.19±2.42）歲。其中女性排除月經(jīng)和妊娠，所有標(biāo)本均無(wú)溶血、黃疸、脂濁。

1.2 儀器與試劑

新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI X8 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，EB VCA IgA 試劑（試劑批號(hào)：0861900401）、EB EA IgA檢測(cè)試劑（試劑批號(hào)：0901900201）。

1.3 方法

1.3.1 精密度 按照CLSI EP15-A2 文件要求[3]，選擇新產(chǎn)業(yè)公司配套的高、低值不同濃度的質(zhì)控品（EB VCA IgA 質(zhì)控品低值、高值批號(hào)分別為：0861900401Q1、0861900401Q2；EB EA IgA 質(zhì)控品低值、高值批號(hào)分別為0901900201Q1、0901900201Q2）作為精密度評(píng)價(jià)的樣本進(jìn)行檢測(cè)，每天分析1 個(gè)批次、2 個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量3 次，連續(xù)測(cè)量5天，分別計(jì)算均值（xˉ），標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV），與廠家聲明CV 值進(jìn)行比較，若實(shí)驗(yàn)結(jié)果CV 值小于廠家聲明，則通過(guò)驗(yàn)證。

1.3.2 敏感性與特異性 收集鼻咽癌患者樣本20例，健康體檢人群樣本20 例，均進(jìn)行EB VCA 和EB EA IgA 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.3.3 方法學(xué)比對(duì) 參考WS/T492-2016 衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及CNANS-GL037:2019 性能驗(yàn)證指南，使用患者樣本不少于20 份，被測(cè)物濃度、活性等在測(cè)量區(qū)間內(nèi)均勻分布，并關(guān)注醫(yī)學(xué)鑒定水平。

1.3.4 線性范圍 參考CLSI EP6-A2 文件要求[3]，分別取EB VCA 和EB EA IgA 的高值（H）和低值（L）校準(zhǔn)品各1 份，按5H、3H+1L、2H+2L、1H+3L 和5L 稀釋，形成系列濃度血清進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)2 次，以稀釋后的理論值為X，實(shí)測(cè)均值為Y，將所有結(jié)果標(biāo)在坐標(biāo)圖上，計(jì)算回歸方程，要求滿足b值在0.95～1.05 范圍之間，相關(guān)系數(shù)R2≥0.95。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（n）和率（%）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

EB VCA IgA 分析總精密度驗(yàn)證結(jié)果為低、高值樣品（CV%）分別為3.978%和2.337%；EB EA IgA 分析總精密度驗(yàn)證結(jié)果為低、高值樣品（CV%）分別為6.078%和4.131%。新產(chǎn)業(yè)生物的EBV VCA IgA 和EBV EA IgA 高低兩個(gè)水平的精密度，均符合廠家聲稱的要求（＜10%）。

2.2 敏感性與特異性

檢測(cè)樣本中EBV VCA IgA 和EBV EA IgA 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果針對(duì)鼻咽癌樣本檢測(cè)陽(yáng)性率（敏感性）分別為100%和86.36%，累計(jì)陽(yáng)性率（敏感性）達(dá)100%，特異性是95.24%；VCA IgA 臨床準(zhǔn)確性為97.56%；EA IgA 準(zhǔn)確性為90.70%。兩者聯(lián)合檢測(cè)可以達(dá)到100%。

2.3 方法學(xué)效果比對(duì)結(jié)果

20 例鼻咽癌患者樣本中，EB VCA IgA 化學(xué)發(fā)光法與間接免疫熒光法血清滴度的陽(yáng)性符合率可達(dá)95.24%，EB EA IgA 化學(xué)發(fā)光法與間接免疫熒光法血清滴度的陽(yáng)性符合率可達(dá)95%，符合總體判斷標(biāo)準(zhǔn)（＞80%）。見(jiàn)表1、表2。

表1 EB VCA IgA 方法學(xué)效果比對(duì)結(jié)果

表2 EB EA IgA 方法學(xué)效果比對(duì)結(jié)果

2.4 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

選取EB VCA IgA和EB EA IgA高濃度（25.4 AU/mL,24.25 AU/mL）和低濃度（2.37 AU/mL，0.44 AU/mL）血清，稀釋后的理論值和實(shí)測(cè)均值見(jiàn)表3，散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 EB VCA IgA 線性范圍散點(diǎn)圖

圖2 EB EA IgA 線性范圍散點(diǎn)圖

表3 3EB VCA IgA 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果（AU/mL）

3 討論

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜，是上皮腫瘤中較為少見(jiàn)的與Epstein-Barr（EB）病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤，鼻咽癌目前屬于常見(jiàn)的、治愈率高的腫瘤性疾病，關(guān)鍵在于早診斷、早治療。然而由于鼻咽部解剖位置隱蔽，鼻咽癌早期癥狀不典型，給早期診斷帶來(lái)了一定的困難。對(duì)于可疑鼻咽癌患者進(jìn)行必要的輔助檢查是對(duì)鼻咽癌進(jìn)行早期診斷和鑒別診斷不可缺少的重要手段。傳統(tǒng)的體檢方法ELISA 法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，假陽(yáng)性與假陰性率較高。磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）的原理是采用雙抗體夾心法。用抗人IGF-1 抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的IGF-1會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IGF-1 抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素。抗人IGF-1 抗體與結(jié)合在包被抗體上的人IGF-1 結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入發(fā)光底物混合液，發(fā)光底物在辣根過(guò)氧化物酶的催化下發(fā)出熒光，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值（RLU），IGF-1 濃度與化學(xué)發(fā)光值之間呈正相關(guān)，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IGF-1 的濃度。因此，近年發(fā)展起來(lái)的化學(xué)發(fā)光法采用雙抗夾心檢測(cè)EB病毒早期抗原EB EA IgA 和衣殼抗原EB VCA IgA，檢測(cè)速度快，準(zhǔn)確性高，方便大批量人群篩查。

本研究中檢測(cè)樣本中EBV VCA IgA 和EBV EA IgA 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果針對(duì)鼻咽癌樣本檢測(cè)陽(yáng)性率（敏感性）分別為100%和86.36%，累計(jì)陽(yáng)性率（敏感性）達(dá)100%，特異性是95.24%；VCA IgA 臨床準(zhǔn)確性為97.56%；EA IgA 準(zhǔn)確性為90.70%。兩者聯(lián)合檢測(cè)可以達(dá)到100%。

綜上所示，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)EBV VCA IgA和EBV EA IgA 的精密度、敏感性與特異性、方法學(xué)比對(duì)、參考區(qū)間驗(yàn)證，性能均可以滿足實(shí)驗(yàn)室與臨床的使用要求。可作為一種EB 病毒早期診斷的快速篩查手段。