EBP50、p16、LMW-PTP 及Ki-67 在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)及臨床意義

谷秀娟，茍江倩，鄭以秀

深圳厚德醫(yī)院婦科，廣東深圳 518110

宮頸癌是一種較常見的惡性腫瘤，病死率在各種婦科惡性腫瘤中居于第2 位，僅次于乳腺癌，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)得知，在全球當(dāng)中，每年新增宮頸癌人數(shù)為50 萬例，其中，我國患病占比達(dá)1/4[1]。宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（cervical squamous intraepithelial lesion, CIN）實(shí)際就是宮頸癌癌前病變，當(dāng)前，臨床其劃分成3 個(gè)等級，即CINⅠ（有著較低癌變可能性并且屬于自限性病變）與有著較高危險(xiǎn)性且可能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┑腃INⅡ、Ⅲ[2]。其中CINⅠ屬于低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL），CINⅡ、Ⅲ屬于高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（highgrade squamous intraepithelial lesion, HSIL）。需指出的是，做到對CIN 的及時(shí)且準(zhǔn)確診治，對于降低宮頸癌發(fā)病、病死率十分關(guān)鍵，尤其是CINⅡ、Ⅲ病變者。有報(bào)道強(qiáng)調(diào)，在宮頸病變進(jìn)展當(dāng)中，磷酸化蛋白50（ERM-binding phosphoprotein, EBP50）、Ki-67、p16、低分子量酪氨酸磷酸酶（low molecular weight protein tyrosine phosphatases, LMW-PTP）均為可靠標(biāo)志物，與增殖細(xì)胞之間存在緊密聯(lián)系，且增殖指數(shù)的高低密切相關(guān)于腫瘤的分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等[3]。為證實(shí)此類指標(biāo)在CIN 中的表達(dá)情況及臨床意義，選取2020 年1 月—2023 年6 月深圳厚德醫(yī)院收治的62 例宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesion, SIL）患者及同時(shí)期62 例宮頸健康者為研究對象，采集其宮頸組織，檢測其中EBP50、Ki-67 等的表達(dá)情況并分析其價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的62 例宮頸SIL 患者及同期62例宮頸健康的健康體檢者為研究對象。宮頸SIL 患者年齡25～35 歲，平均（29.62±2.79）歲；體質(zhì)指數(shù)19～32 kg/m2，平均（25.94±1.32）kg/m2；經(jīng)宮頸活檢或手術(shù)切除獲取宮頸組織，共62 份，其中LSIL 18 份，HSIL 44 份。健康體檢者年齡25～35 歲，平均（29.60±2.75）歲；體質(zhì)指數(shù)20～31 kg/m2，平均（25.91±1.35）kg/m2；采集其正常宮頸組織，共62 份。兩組研究對象一般資料對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。患者及其家屬均知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 方法

兩組標(biāo)本都采用中性福爾馬林（10%）進(jìn)行固定，且實(shí)施組織脫水及石蠟包埋。

①試劑。選用產(chǎn)自Abcam 公司的兔抗人EBP50 單克隆抗體，及購自美國Santa Cuze 公司的LMW-PTP 單克隆抗體；采用購自福州邁新公司的小鼠抗人 p16、Ki-67 單克隆抗體及免疫顯色試劑。②免疫組化檢測EBP50、LMW-PTP、p16 與Ki-67 表達(dá)。石蠟切片脫蠟至水，采用H2O2甲醇溶液（3%）將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，以微波熱處理方法對抗原進(jìn)行修復(fù)，后分別將Ki-67（1 ∶ 100）、p16（1 ∶100）、EBP50（1 ∶ 200）、LMW-PTP（1 ∶ 200）抗體加入，待孵育過夜后（4℃），將免疫顯色試劑加入，在特定溫度下（37℃）再孵育30 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色液，并且用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，然后對切片進(jìn)行脫水、封固處理。鱗酸鹽緩沖液代替一抗，作為陰性對照。

1.3 觀察指標(biāo)

①EBP50。EBP50 蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核。參照臨床病理特征的相似性，把EBP50 陰性與弱染色明確為低表達(dá)，而將中、強(qiáng)染色當(dāng)作高表達(dá)。②p16。p16 陽性染色實(shí)際就是鱗狀上皮下1/2，或者是超過下1/2，有連續(xù)彌漫性的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核染色出現(xiàn)；而p16 局灶斑點(diǎn)狀上皮染色或者完全不染色，即陰性表達(dá)。③Ki-67。Ki-67 的核染色多出現(xiàn)副基底層，而且陽性細(xì)胞數(shù)＜30%，即陰性表達(dá)；若超出副基底層以上且有細(xì)胞核染色出現(xiàn)，同時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)≥30%，即陽性表達(dá)。④LMW-PTP[4]。參照細(xì)胞陽性著色程度（抗原含量）：0 分為陰性，1 分為弱陽性，2 分為中等陽性，3 分為強(qiáng)陽性；根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量：無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞數(shù)為0～＜10%為1 分，10%～＜50%之間為2 分，50%～80%為3分，＞80%為4 分；以積分綜合計(jì)量，總積分=著色強(qiáng)度×著色細(xì)胞數(shù)，陰性表達(dá)：0 分，低表達(dá)：1～4 分，高表達(dá)：＞4 分。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）和率（%）表示，組間及組內(nèi)比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIL 患者宮頸組織與正常宮頸組織中EBP50、LMW-PTP、p16、Ki-67 表達(dá)對比

SIL 患者宮頸組織中EBP50、LMW-PTP 表達(dá)低于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SIL患者宮頸組織中Ki-67、p16 的表達(dá)高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 HSIL 與LSIL 患者宮頸組織中EBP50、LMWPTP、p16、Ki-67 表達(dá)對比

HSIL 患者宮頸組織中EBP50、LMW-PTP 的高表達(dá)率低于LSIL 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HSIL 患者宮頸組織中p16、Ki-67 表達(dá)陽性率高于LSIL 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

SIL 實(shí)為一種與子宮頸浸潤癌緊密相關(guān)的一組子宮頸病變，以25～35 歲婦女最為多發(fā)。大多數(shù)LSIL 可自然消退，但HSIL 具有癌變潛能。需指出的是，通過對宮頸SIL 實(shí)施病理診斷，對于阻滯宮頸SIL 轉(zhuǎn)變或進(jìn)展為浸潤性宮頸癌十分關(guān)鍵。近年來，有報(bào)道指出，在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中，EBP50、LMW-PTP 起到關(guān)鍵性作用。在諸如食道癌、大腸癌、膽管癌等腫瘤中，EBP50、LMW-PTP 的表達(dá)顯著減少，而且還密切相關(guān)于腫瘤的T 分期、分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[5]；但需指出的是，有關(guān)其在宮頸SIL 當(dāng)中的表達(dá)情況，少有報(bào)道。雖然在宮頸癌變當(dāng)中p16 聯(lián)合Ki-67 進(jìn)行檢測對HSIL 檢測率的提高有利，但EBP50、LMW-PTP 與p16、Ki-67之間的相關(guān)性報(bào)道并不多。本文以免疫組化方式就EBP50、LMW-PTP 與p16、Ki-67 在宮頸SIL 患者宮頸組織與正常宮頸組織中的表達(dá)情況進(jìn)行對比，且剖析其在宮頸SIL 患者宮頸組織當(dāng)中表達(dá)的相關(guān)性，從中明確此類指標(biāo)的表達(dá)情況及臨床診斷意義。

近年來，宮頸癌患者人數(shù)呈現(xiàn)逐年快速增多趨勢。LSIL 能夠自行消退，但HSIL 容易進(jìn)展為浸潤性癌。有研究發(fā)現(xiàn)，在患者臨床治療中，SIL 分級的病理診斷尤為重要[6]。故在宮頸病變臨床診治中，找尋一些生物標(biāo)志物來對SIL 實(shí)施輔助診斷，十分必要。針對EBP50 而言，其實(shí)為一種由兩個(gè)處于串聯(lián)狀態(tài)的PDZ 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，積極參與到蛋白質(zhì)間的相互作用當(dāng)中。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常宮頸組織當(dāng)中，EBP50、LMW-PTP 均有較高的表達(dá)率，而在宮頸SIL 患者宮頸組織當(dāng)中，則表達(dá)率明顯下降（P＜0.05）；另外，其在LSIL 當(dāng)中的高表達(dá)較HSIL 高（P＜0.05）。表明在宮頸SIL 患者宮頸組織當(dāng)中，EBP50、LMW-PTP 可能喪失保護(hù)宮頸鱗狀上皮的作用。p16 為一種典型的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，不僅能抑制細(xì)胞生長，而且還能抑制腫瘤的生物學(xué)活性。有學(xué)者指出，在正常的宮頸鱗狀上皮當(dāng)中，p16偶爾有局灶陽性或者完全缺失[7]。HPV E7 蛋白會對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白進(jìn)行抑制，造成子宮頸細(xì)胞大量增殖及p16 蛋白的不斷積聚，故p16 有助于宮頸疾病診斷準(zhǔn)確性的提高。有研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7m RNA 高表達(dá)實(shí)為子宮頸癌變的一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志[8]。HPV16 病毒所分泌的癌蛋白E6，能夠以一種PDZ 依賴方式與EBP50 相結(jié)合，加速EBP50 的降解。E7 能夠借助CDK1/2 對EBP50 進(jìn)行誘導(dǎo)，使其不斷磷酸化，因而會加速E6 結(jié)合及對EBP50 進(jìn)行降解。LMW-PTP 能夠加速腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，并且與膜細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白埃茲蛋白之間能夠相互作用，從而參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移當(dāng)中。有研究發(fā)現(xiàn)，LMW-PTP 等溶酶體酶在乳腺癌當(dāng)中能夠以胞吐作用的方式對細(xì)胞進(jìn)行破壞，引發(fā)腫瘤，且升高LMW-PTP 的活性[9]。本研究得知，在宮頸SIL 患者宮頸組織中，p16 的陽性率自LSIL 到HSIL 有明顯上升（P＜0.05），表明p16 對SIL 的分級識別有利。多數(shù)LSIL 患者的EBP50、LMW-PTP 呈高表達(dá)，p16呈現(xiàn)為陰性表達(dá)；而在HSIL 患者當(dāng)中，多數(shù)p16（93.55%）為陽性，而EBP50（22.58%）、LMW-PTP（19.35%）呈低表達(dá)。與高娜等[10]研究中HSIL 患者宮頸組織中多數(shù)p16（91.19%）為陽性，而EBP50、LMW-PTP 呈低表達(dá)的結(jié)果具有一致性。對于Ki-67，其實(shí)為一種細(xì)胞增殖指標(biāo)，同時(shí)還是一種在增殖細(xì)胞當(dāng)中表達(dá)的核抗原。需指出的是，除了靜止期之外，其在細(xì)胞周期的全部階段都有表達(dá)。Ki-67 染色能夠?qū)IL 進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測，在此方面較標(biāo)準(zhǔn)的組織病理學(xué)分級優(yōu)。本研究得知，LSIL 患者宮頸組織中Ki-67 的陽性率較低，而在HSIL 患者宮頸組織中則較高，提示Ki-67 在LSIL 患者宮頸組織中的陽性率較HSIL 低（P＜0.05）。p16、Ki-67 相對應(yīng)的免疫組化結(jié)果實(shí)為對HSIL、LSIL 實(shí)施病理診斷的關(guān)鍵參考指標(biāo)[11-12]。

綜上所述，EBP50、LMW-PTP 表達(dá)在正常宮頸組織當(dāng)中，多為高表達(dá)，而在宮頸SIL 患者宮頸組織當(dāng)中多為低表達(dá)；Ki-67、p16 的表達(dá)都伴隨SIL 級別的增加而隨之升高，而EBP50、LMW-PTP 與SIL 級別呈負(fù)相關(guān)。對此，推測EBP50、LMW-PTP 可用于SIL 的早期診斷，可作為其免疫標(biāo)志物。