偏最小二乘輔助紫外可見光譜法同時測定煙草中的葡萄糖與木糖含量

李 宇,張克燦,彭麗娟,朱正良,何 亮*

1. 昆明理工大學化學工程學院,云南 昆明 650500 2. 云南省煙草質量監督檢測站,云南 昆明 650106

引 言

煙草中的糖類物質在燃燒條件下可熱裂解產生各種新生化合物,從而影響卷煙的香氣和口感,對不同的糖組分還會產生不同影響[1]。 研究表明,卷煙中葡萄糖含量能夠豐富卷煙香氣,提高煙氣的圓潤性; 果糖含量有利于提高煙葉的綿延性和甜度,減少雜氣; 木糖含量有利于提高煙氣的潤感與口感的甜味,使得香氣質感更細膩柔滑[2-4]。 由此可見,對煙草中的單糖含量進行準確檢測是實現煙草行業品控分析的重要前提。 目前,煙草行業主要通過氣相色譜法[5]和高效液相色譜法[6]對煙草中的不同單糖進行定量分析。 然而,氣相色譜法需要對糖類化合物衍生化后才能分析,操作較麻煩; 相對于氣相色譜法,高效液相色譜經樣品前處理后可直接進樣,但同樣存在前處理麻煩的問題,如需用固相萃取柱預分離等,且兩種方法的儀器設備成本普遍較高。 因此,在煙草行業當中迫切需要開發一種簡單、 快速的單糖分析方法。

對于還原糖來說,其在高溫酸性條件下可水解為糠醛和5-羥甲基糠醛[7],很容易與顯色物質絡合并在可見光區域形成特征吸收峰,從而通過簡單的紫外/可見光譜法實現快速定量檢測。 然而由于原料的特殊性,煙草中的煙堿、 茄尼醇、 單寧、 色素等物質容易與糖類一起溶解到浸提液體中,使得液體呈深黃色從而干擾光譜的檢測結果。 在早期的工作中會加入一定量的活性炭粉末來消除這一干擾,但是該過程往往需要較長的脫色時間(30～60 min),而且還會吸附一定量的待測組分,影響測量準確性。 有研究表明[8],將浸提液高倍稀釋可以消除這一干擾,但是對檢測方法的準確性提出了更高的要求。 本工作嘗試將準確度較高的間苯三酚顯色法應用于煙草浸提液的檢測當中,通過對顯色機理進行合理猜想并對反應條件進行調整,解決了該檢測體系下葡萄糖顯色效果不佳的技術問題。 這同時也導致了檢測葡萄糖與木糖混合溶液時最終結果嚴重相互干擾,無法使用雙波長技術實現同時定量分析,因此需要引進多元校正方法。

本工作在優化間苯三酚顯色法過程條件的基礎上,通過二維相關性矩陣,建立偏最小二乘法回歸[9](PLS)輔助同步定量測定煙草浸提液中的葡萄糖與木糖含量的預測模型。 經過方法驗證并與高效液相色譜法比較過后,結果表明,該方法能夠快速、 準確測定煙草制品浸提液中的葡萄糖與木糖含量,可以為煙草行業提供有效、 便捷的單糖分析方法。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

煙葉、 煙梗原料與煙草制品1#—7#由云南省昆明市某煙草公司提供,煙草浸提液參考國家標準YC/T31—1996處理得到。

所使用的所有化學品,包括乙酸、 鹽酸、 間苯三酚等均為分析級,可由商業途徑獲得。 標準糖樣品D-葡萄糖(99%)與D-木糖 (99%) 為生化試劑,購自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準糖溶液的配制

分別配制10.00 mmol·L-1的葡萄糖與木糖儲備母液,稀釋得到濃度范圍為0.01～2 mmol·L-1的標準溶液。 總糖溶液由上述兩種糖液隨機等體積混合得到。

1.2.2 水解反應

移取1 mL標準糖或樣品溶液于25 mL具塞比色管中,加入4 mL濃鹽酸與1 mL冰醋酸,搖勻后置入沸水浴中反應40 min,反應完成后立即取出試管,放入冷水中冷卻5 min,以1 mL去離子水進行相同的水解反應為空白樣。

1.2.3 顯色劑制備及顯色反應

制備間苯三酚/乙醇顯色劑: 準確稱取0.4 g 間苯三酚溶于20 mL無水乙醇中,混合均勻后靜置,待溶解完全后備用,每次實驗現配現用。

顯色反應: 移取1 mL顯色劑溶液加入到冷卻好的水解液中,迅速搖勻后置于Agilent-8453型紫外-可見分光光度計中進行全波長掃描,以空白樣進行上述相同的反應過程作為參比。

1.2.4 高效液相色譜(HPLC)法對比

方法對比采用高效液相色譜法,儀器工作條件為采用紫外檢測器和島津C18分析柱(Shimadzu,4.6 mm×250 mm,5 μm),測量在Dionex UltiMate 3000系統(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)上進行; 柱溫45 ℃; 流動相為純乙腈與0.05 mol·L-1磷酸緩沖溶液(pH 6.8); 進樣量1 μL; 紫外檢測波長為245 nm。

2 結果與討論

2.1 間苯三酚法顯色機理

在常溫條件下,間苯三酚可以與甲醛在酸性介質中反應生成黃色化合物[10-11]。 證實了與間苯三酚發生顯色反應的官能團主要為醛基,因此葡萄糖與木糖脫水形成的糠醛和5-羥甲基糠醛都應能夠與間苯三酚發生顯色反應,特征峰強度差異主要歸因于二者結構上的不同。 通過借鑒間苯三酚與甲醛的顯色機理,在此提出了常溫酸性條件下間苯三酚對于5-羥甲基糠醛、 糠醛的顯色機理猜想,如圖1所示。 在酸性條件下,H+首先活化5-羥甲基糠醛或糠醛的羰基,從而使得一分子醛基和一分子間苯三酚進行親電取代,生成間苯三酚的糠醛衍生物(化合物3)。 在過量H+作用下,化合物3中羥基上的氧作為親核試劑繼續進攻缺電子的氫離子,使羥基變成一個易離去基團,以水的形式脫離并得到中間產物4。 中間產物4可能是由于五個雙鍵和碳正離子的缺電子p—π共軛而對瞬態黃色做出反應的物種[12]。 最終產物5沒有很強的共軛性,因此顏色會逐漸褪去[10]。

圖1 間苯三酚法顯色機理Fig.1 Speculation on the color development mechanism of phloroglucinol

2.2 對間苯三酚顯色法的改進

本工作旨在解決間苯三酚檢測體系中對葡萄糖顯色效果不佳的技術問題。 傳統的間苯三酚顯色法中,木糖在高溫酸性條件下轉化為糠醛,并與間苯三酚發生縮合反應,生成紅色的2,3’,4,5’,6-五羥基聯苯產物[13]。 然而,由于糖組分和間苯三酚長時間暴露在濃酸溶液當中,顯色產物較穩定但檢測靈敏度會有所降低[14]。 此外,傳統間苯三酚法加入了大量冰醋酸和強脫水性的濃硫酸,起到催化作用以減少反應時間。 結合前人的研究,葡萄糖在水中主要為穩定的吡喃式結構,難以形成糠醛衍生物,相比木糖需要更長的反應時間[15]。 因此,基于2.1的顯色機理,本工作采用反應條件更加溫和的濃鹽酸和減少水解步驟中冰醋酸用量以延長反應時間,使葡萄糖充分轉化。 將顯色反應置于水解完成之后并在常溫下進行,以提高檢測靈敏度。 這些步驟理論上可以增加間苯三酚檢測體系下葡萄糖與木糖的顯色結果差異,從而使間苯三酚法應用于葡萄糖的檢測。

2.3 波長的選擇

將0.1 mmol·L-1木糖與葡萄糖溶液經1.2.2與1.2.3步驟后,以波長為橫坐標,吸光度為縱坐標分別繪制在可見光區的吸收光譜圖,結果如圖2所示。 木糖和葡萄糖與間苯三酚顯色劑反應后,分別在波長478和470 nm處有最大吸收,符合2.1對于顯色機理的猜想。 木糖、 葡萄糖與間苯三酚發生顯色反應的官能團為脫水反應生成的醛基,二者由于結構差異導致特征吸收峰產生偏移。 而相同濃度的木糖與葡萄糖溶液水解后,木糖表現的特征吸收比葡萄糖要高得多,因此選擇478 nm作為測定木糖的波長,470 nm作為測定葡萄糖的波長。 為了使吸收峰強度適宜,在后續優化實驗中選擇0.1 mmol·L-1木糖溶液、 1.0 mmol·L-1葡萄糖溶液進行。

圖2 木糖和葡萄糖溶液的紫外可見原始光譜Fig.2 UV-Vis original spectrum of xylose and glucose solution

2.4 脫水過程參數的影響分析

為對脫水過程參數進行優化,對濃酸用量、 水解時間、 水解溫度三個參數進行最優條件探討,實驗結果如圖3所示。 為探索最適合的濃鹽酸用量,分別測定葡萄糖與木糖溶液加入1～5 mL的濃鹽酸進行水解后的吸光度,結果如圖3(a)所示。 在濃鹽酸用量在3.5～4 mL之內葡萄糖和木糖溶液均有較高的吸光度,為了保證充分反應,選擇4 mL作為濃鹽酸的最佳添加量。

圖3 (a)不同濃鹽酸用量; (b)不同水解時間; (c) 不同水解溫度下葡萄糖/木糖溶液的吸光度變化情況Fig.3 The absorbance of glucose/xylose solutions at (a) different amounts of concentrated hydrochloric acid; (b) different hydrolysis time; (c) different hydrolysis temperatures

不同水解時間對顯色結果的影響如圖3(b)所示。 可以看出,當水解時間從10 min增加到30 min時,吸光度呈現快速的上升趨勢并在40 min時達到頂點,這是由于濃鹽酸所提供的溫和反應環境導致反應時間延長所致。 當水解時間超過40 min后,吸光度呈下降趨勢; 這是由于糠醛與5-羥甲基糠醛在高溫條件下穩定性較差,容易發生交叉聚合與自聚合反應[16]。 此方法對應的最佳水解時間為40 min。

溫度是影響糖組分脫水反應高效、 穩定進行的另一重要條件。 不同水解溫度下,葡萄糖/木糖的紫外吸收結果如圖3(c)所示。 隨著溫度從60 ℃升到100 ℃,糖組分樣品溶液的吸光度也在不斷升高。 當水解溫度達到110 ℃時(反應在高壓蒸汽鍋中進行),水解液的吸光度卻顯著下降,并且發現水解液變渾濁。 可以猜測在高壓高溫條件下部分糖組分可能發生了碳化。 因此,本實驗確定了100 ℃沸水浴為最優的水解溫度。

2.5 顯色反應參數的影響

配制不同濃度的間苯三酚/乙醇溶液,研究顯色劑濃度對測定結果的影響,結果如圖4(a)所示。 間苯三酚濃度為2%時,樣品溶液可以達到最大顯色效果。 實驗過程中還觀測到當過度添加間苯三酚時(>5.0%),樣品吸光度會有較大幅度的降低,結合圖1的猜測,過量的間苯三酚會促進最終產物(化合物5)的生成,導致顯色效果降低。

圖4 (a)不同顯色劑濃度; (b)不同顯色時間下葡萄糖/木糖溶液的紫外吸光度變化情況Fig.4 The absorbance of glucose/xylose solutions at (a) different chromogenic concentrations; (b) different chromogenic time

檢測過程中,還觀測到在加入顯色劑的瞬間,水解液顏色迅速從無色變為黃色,然后又在0.5 h內逐漸變為無色,這一現象與Li[10]的實驗現象一致。 為探究該顯色反應的穩定性,分別測定葡萄糖和木糖在不同顯色時間的吸光度,結果如圖4(b)所示。 顯色反應在0～2 min之內保持穩定,但在2 min之后顯色效果迅速下降,在10 min時顯色效果下降了接近60%。 可見,顯色物質作為一種反應中間體并不穩定,在添加顯色劑之后必須快速進行檢測; 1～2 min之內為最佳的檢測時間。

2.6 提取液中干擾物質的影響

由2.1可知,含有醛基的有機物質可能與顯色反應試劑中的間苯三酚顯色,對戊糖和己糖的測定產生干擾。 主要探討了提取液中可能含量較高的木素對測定結果的影響。 將硫酸鹽木素采用酸析法[17]分離純化后添加到混糖溶液中,按1.2的步驟進行檢測,由圖5的光譜結果可以明顯發現,木素并未與間苯三酚發生反應,而影響顯色反應。 因此可得出結論,木素對本方法分析結果沒有干擾。

2.7 繪制標準工作曲線

分別配制濃度為0.1～2.0和0.01～1.0 mmol·L-1的葡萄糖與木糖的標準溶液(圖6)。 由圖6(a)可知,在葡萄糖濃度范圍在0.1～0.80 mmol·L-1時標準曲線的線性關系良好,其方程為Y=1.413 8x-0.019 6,相關系數R2=0.996 1。 由圖6(b)可知,在木糖濃度范圍在0.15～0.40 mmol·L-1時標準曲線的線性關系良好,其方程為Y=4.423 9x+0.010 1,相關系數R2=0.996 2。 由于該方法的靈敏度較高,當糖溶液的濃度較高時吸光度會偏離朗伯-比爾定律,可以進行適當的稀釋后再進行檢測。

圖6 標準關系曲線(a): 葡萄糖; (b): 木糖Fig.6 Standard relationship curve(a): Glucose; (b): Xylose

2.8 偏最小二乘法回歸分析建模及模型驗證

本方法可顯著提高葡萄糖的檢測靈敏度。 然而,木糖也會在該條件下顯色,且顯色后的特征吸收峰位置十分接近,如圖7(a)所示。 顯然,測定上述兩種糖組分時,會相互影響彼此的測量準確性。 圖7(b)為不同濃度的葡萄糖和木糖顯色后的可見光譜,可以看出相同摩爾濃度的葡萄糖和木糖經顯色反應后沒有一個固定的等摩爾吸收波長,因此難以采用常用的雙波長技術建立準確的量化關系。 為了實現同時分析兩種糖組分與顯色結果的交互作用,需要采用多維數據分析方法進行校正。

圖7 (a)單糖與混糖的紫外可見原始光譜; (b) 0.1～1.0 mmol·L-1葡萄糖(間隔0.1)與0.05～0.5 mmol·L-1木糖(間隔0.05)的紫外可見原始光譜Fig.7 (a) UV-Vis original spectra of monosaccharides and mixed sugars; (b) UV-Vis original spectra of 0.1～1.0 mmol·L-1 glucose (spaced 0.1) and 0.05～0.5 mmol·L-1 xylose (spaced 0.05)

使用偏最小二乘法回歸(PLSR)對煙草樣品中混合糖對應的紫外吸收光譜數據進行了分析,分析過程在SIMCA-P 14.1 軟件上實現。 設20組不同混糖溶液中木糖與葡萄糖的濃度構成的數據矩陣X為自變量,樣品對應的紫外光譜吸光度信號值構成的數據矩陣Y為因變量。 則自變量數據集X={x1,x2}20×2和因變量數據集Y={y1,y2,…,y20}20×1可表示為如式(1)所示的線性模型

Y=XZ+E

(1)

式(1)中,Z為回歸系數矩陣,E為殘差矩陣,則其最小二乘解為式(2)

Z=(XTX)-1XTY

(2)

將濃度數據矩陣X和吸光度信號值矩陣Y分別采用NIPALS算法[18]做雙線性分解,分解成的特征向量表達式為

X=TPT+F

(3)

Y=UQT+E

(4)

式(3)和式(4)中,T和U分別為矩陣X和Y的得分矢量,P和Q則分別為它們的特征矢量,F為殘差矩陣。 其中,T和U需滿足盡可能多的攜帶濃度數據矩陣、 吸光度信號值矩陣中的變異信息,且其相關程度均達到最大的要求[19]。

為了評價上述模型的精確度,通過相同實驗條件下得到的預測數據和實際數據的內外部驗證分析,如圖8(a)所示。 可知經所建立模型預測的數據與實際實驗結果高度一致(R2為0.994 7)。 說明在本文選取的實驗參數范圍內,該模型可以有效地預測混糖中木糖與葡萄糖的含量。 為了進一步分析預測模型的穩健性,研究了預測值和測量值之間的相對偏差(RD),如圖8(b)所示。 可以看出,實際的實驗數據模型預測的數值之間的相對偏差大多在10%以內,且在零線附近隨機分布。 該檢驗結果說明了所建立的模型具有良好的穩健性,可以精準應用于改進后的間苯三酚法定量測量混糖溶液中木糖與葡萄糖的含量。

圖8 (a) PLSR模型預測數據與實測數據的相關性分析; (b) 吸光度預測值與實測值之間的偏差值Fig.8 (a) Correlation analysis between the predicted and measured data of the PLSR model; (b) Deviation values between the predicted and measured values of absorbance

2.9 方法驗證

對本分析方法的靈敏度、 精密度和回收率進行了逐一驗證。

方法的靈敏度測定方法: 取最低濃度標準工作液,重復測定10次的標準偏差(SD),葡萄糖溶液為0.000 6 mmol·L-1,木糖溶液為0.002 4 mmol·L-1,按照3倍SD、 10倍SD計算得出本方法對葡萄糖溶液的檢出限和定量限分別為0.001 7和0.005 7 mmol·L-1,對木糖溶液的檢出限和定量限分別為0.007 2和0.024 mmol·L-1,表明該方法的靈敏度令人滿意。

精密度的測定將葡萄糖和木糖的A—C三個樣品分別連續檢測3次,結果見表1。 可知,批內變異系數的范圍為0.69%～3.03%,說明該方法的精密度高。

表1 方法的精密度Table 1 Precision

回收率的檢驗通過在已知含量的樣品溶液進行相同實驗,比較實測值和理論值得到。 實驗結果如表2所示,表明采用本方法所測總糖、 木糖和葡萄糖的回收率范圍均在95%～105%內,說明該檢測方法結果準確、 可靠。

表2 加標回收率Table 2 Standard recovery rate

2.10 方法對比

為了驗證本方法與其他方法的測量結果一致性,采用了常規的PMP衍生化高效液相色譜(HPLC)法[20]對1—7組不同煙草制品中的糖含量進行了測定和對比,實驗結果為三次實驗的平均值(表3)。 煙草薄片與卷煙煙絲等煙草制品在經過加工工藝后,基本不含有木糖,只需檢測葡萄糖含量。 這一點通過圖7(a)的出峰位置即可初步判斷,使用圖6(a)的標準曲線即可準確測量葡萄糖含量。 煙草原料和再造煙葉中的木糖含量較高,需要使用本方法建立的PLS模型預測葡萄糖與木糖含量。 本方法與HPLC法測定的9個樣品中葡萄糖與木糖含量相對偏差均在10%以內,表明本方法可用于煙草行業中測定煙草制品與原料中的葡萄糖和木糖含量。

表3 兩方法比較實驗結果Table 3 Comparison of experimental results between the two methods

3 結 論

基于對間苯三酚法顯色機理進行探究,對間苯三酚法進行改進以提高該檢測體系下葡萄糖的顯色效果,并且結合PLS建立預測模型達到高稀煙草浸提液中混糖的測定標準。 結果表明,該方法具有操作簡便快速、 分析效率高的優點,而且準確度和精密度都十分良好,能夠滿足行業對煙草和煙草制品中的葡萄糖和木糖含量進行大批量、 快速、 準確檢測的需要。 通過二維相關性矩陣,建立了穩健的PLS模型輔助同步定量測定葡萄糖與木糖含量,具有重要的現實意義。