內生菌對干旱脅迫下甘蔗的生理響應及抗旱性評價

羅艷菊 謝林艷 鄒清林 李四杰 劉涵 劉魯峰 何麗蓮 李富生

（云南農業大學農學與生物技術學院，昆明 650201）

甘蔗（Saccharum officinarumL.）是世界上重要的農作物之一，也是我國最主要的糖料作物和能源作物［1］。目前，將近有130 多個國家進行甘蔗的種植，占地約2 600 萬hm2［2］。干旱嚴重限制著甘蔗產業的發展。我國的廣西、廣東、云南等甘蔗主要種植區，大部分地區是坡地，容易遭受水分虧缺的問題，嚴重影響著甘蔗產業的發展［3］。甘蔗是一種喜水作物，也是一種耗水作物，其生長對缺水高度敏感，缺水可導致高達60%的產量損失，在印度容易發生干旱的甘蔗覆蓋面積約297 萬hm2［4-5］。我國80%以上的甘蔗種植均在半干旱或干旱區，干旱頻繁發生，造成的損失尤為嚴重［6］。隨著全球氣候變暖，未來干旱災害可能會更加頻繁和嚴重，中國南方原本濕潤的地區可能將面臨干旱的趨勢。甘蔗生長期內短期干旱的風險正在增加，未來甘蔗干旱面積將逐漸增加，可能導致目前高適宜甘蔗種植區達到耐旱極限［7］。

在自然界中，植物與微生物可以形成有益的關系，這些微生物可以促進植物生長并適應環境脅迫［8］。內生菌普遍存在于幾乎所有植物中，能賦予植物多種抗性和進化策略［9］。因此，明確內生菌對甘蔗抗旱性的生理響應對甘蔗內生菌的開發利用及甘蔗旱地抗旱栽培技術的推廣具有重要意義。張文英等［10］發現干旱脅迫下，接種印度梨形孢菌增強了玉米的抗旱性；Morales?Quintana 等［11］也表明干旱脅迫下接種內生菌提高了水分限制條件下草莓的存活率。此外，由于存在當地微生物群，且自然棲息地是非無菌環境，多種內生菌聯合接種比單一接種更能模擬自然條件，并且被認為在非無菌的自然環境中更具競爭力和有效性［9］，而且有研究表明聯合接種內生菌比單獨接種效果更佳［12］。因此，有必要研究在非無菌的干旱脅迫下不同內生菌組合接種的協同效應，確定宿主植物和內生菌之間的有利組合。

利用內生有益真菌改善宿主的耐旱性已在多種作物中被報道［10,13］，而對于利用內生細菌緩解甘蔗干旱脅迫的研究卻鮮有報道［14］。

本研究擬在探究接種內生細菌對干旱脅迫下甘蔗生理影響的基礎上，揭示內生菌株緩解甘蔗干旱脅迫的生理響應機制，為旱地蔗區的栽培和甘蔗的增產增收提供新的途徑和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗材料‘新臺糖22’（‘ROC22’）取自云南農業大學甘蔗研究所資源圃。

1.1.2 菌株材料 前期云南農業大學甘蔗研究所篩選并保存的體外耐旱性較強的4 株甘蔗內生菌株K5、ZM、D58、TY93（ 其中，K5、ZM、YT93、D58 均為甘蔗內生菌的代號名稱）。經16S rDNA 測序鑒定，其中，K5 為考克氏菌（Kocuriasp），登錄號為OP737815；ZM、D58 和YT93 均為芽孢桿菌（Bacillussp.），登錄號分別為OP740361、OP984326和OP738299。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗在云南農業大學試驗基地的大棚內進行。選擇‘新臺糖22’作為試驗材料，催芽2 周后選擇大小均勻的芽進行種植，種植的塑料盆規格為28 cm×30 cm，每盆種植1 個單芽，種植后清水正常澆灌，10 d 后進行菌株菌懸液澆灌處理，菌懸液濃度為1×107CFU/mL，之后每隔2 周進行一次菌株菌懸液澆灌，甘蔗生長到2 個月左右的苗期進行干旱脅迫處理。其中正常供水的土壤含水量保持在25%-30%；中度脅迫的土壤含水量為10%-12.5%［15］；各處理停止澆水9 d 后達到中度干旱，第10 天上午進行葉片取樣，脅迫開始期間每天19:00采用土壤水分溫度測定儀測定土壤含水量。脅迫完成取樣后進行復水處理（土壤含水量保持在25%-30%），復水4 d 后取樣。

盆栽分別設置8 個處理，每個處理6 個重復，共48 盆。8 個處理分別為：（1）對照：非干旱+清水澆灌（CK）；（2）干旱+清水澆灌（WD）；（3）干旱+內生菌K5 菌懸液澆灌（KD）；（4）干旱+內生菌ZM 菌懸液澆灌（ZD）；（5）干旱+內生菌YT93 菌懸液澆灌（YD）；（6）干旱+內生菌D58菌懸液澆灌（DD）；（7）干旱+內生菌ZM、YT93、D58 組合菌懸液澆灌（TD）；（8）干旱+內生菌K5、ZM、YT93、D58 組合菌懸液澆灌（FD）。

1.2.2 測定指標與測定方法 取甘蔗植株+1 葉，擦凈表面污漬后，液氮速凍，?80℃保存備用。使用蘇州格銳思生物科技有限公司生產的超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化物酶試劑盒、丙二醛試劑盒、脯氨酸試劑盒、葉綠素試劑盒、可溶性糖試劑盒，分別測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化物酶（peroxidase, POD）的活性及丙二醛（malondialdehyde, MDA）、脯氨酸（proline, Pro）、葉綠素（chlorophyll, ChI）、可溶性糖（soluble sugar,SS）的含量，并采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白（soluble protein, SP）的含量。

1.2.3 抗旱性綜合評價 首先對干旱脅迫下7 個處理的9 個生理指標進行相關性分析，對比各指標間的相關性，隨后采用主成分分析的方法對各指標進行降維處理，篩選出抗旱性綜合指標，最后采用隸屬函數法對其進行抗旱性綜合評價［16-18］。

1.2.3.1 隸屬函數值

公式中：Ui為隸屬函數值，PCmin為7 個處理中第i 個主因子得分最小值；PCmax為7 個處理的第i個主因子得分最大值。

1.2.3.2 主因子權重

公式中：Pi為主成分分析后所得的第i 個綜合指標的貢獻率。

1.2.3.3 抗旱性綜合評價值

1.2.4 灰色關聯度分析 選擇抗旱性綜合評價值（D值）為參考序列X0，各指標為比較序列，記作Xi（i=1，2…7）。

1.2.4.1 變量數據無綱量化處理 對各變量的數據進行無綱量化處理，此處利用公式（4）均值化的方法進行數據處理：

公式中：x'j為標準化后的數據，為各指標變量的平均值，Sj為各指標變量的標準差。

1.2.4.2 差序列、關聯系數和關聯度計算差序列：

并求出差序列的最小絕對差值和最大絕對差值，代入公式（6）計算關聯系數，最后計算各指標與D值的關聯度［17,19］。

1.2.5 數據處理 采用Excel 2019、SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析、相關性分析、主成分分析、隸屬函數分析和灰色關聯度分析，使用GraphPad Prism8.0.2 軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 干旱脅迫下接種內生菌對甘蔗苗期葉片相對含水量和離體失水率的影響

與CK 相比較，干旱脅迫下各處理甘蔗植株苗期的葉片相對含水量（RWC）降低，其中，WD 降低的程度顯著低于其他處理，復水后，除了WD 處理的葉片相對含水量恢復得較慢，其他處理的葉片相對含水量均恢復到與CK 相近的水平（圖1?A）。各處理的離體失水率（RWL）均顯著低于CK，干旱脅迫處理中WD 處理的離體失水率最低，且復水后各處理的RWL 也顯著低于CK（圖1?B）。

圖1 干旱和復水對各處理甘蔗苗期葉片相對含水量和離體失水率的影響Fig. 1 Effects of drought and rehydration on the relative water contents and in vitro water loss of sugarcane leaves at seedling stage

2.2 干旱脅迫下接種內生菌對甘蔗苗期葉片滲透物質的影響

相比于CK，干旱脅迫使甘蔗植株葉片中的Pro含量迅速增加，各處理中，ZD 和KD 處理的Pro 增加效果較為顯著，復水4 d 后又迅速減少，但還是顯著高于CK（圖2?A）。干旱脅迫下KD、DD、FD處理的SS 含量顯著增多，各處理在復水4 d 后SS含量又迅速降低，除YD、FD 處理外，其他處理在復水后的SS 含量與CK 的含量相近（圖2?B）。干旱脅迫使甘蔗葉片中的SP 含量升高，其中接種內生菌的處理，其SP 的含量顯著高于未接菌的處理，復水后葉片中的SP 含量又逐漸降低，但降低的速度較慢（圖2?C）。此外，干旱也使得甘蔗植株葉片中的MDA 含量顯著增加，并且WD 處理的MDA 含量顯著高于其他處理（圖2?D）。

圖2 干旱和復水對各處理甘蔗苗期葉片Pro、SS、SP 和MDA 的影響Fig. 2 Effects of drought and rehydration on the Pro, SS, SP and MDA contents of sugarcane leaves at seedling stage

2.3 干旱脅迫下接種內生菌對甘蔗苗期葉片抗氧化酶活性的影響

干旱脅迫下甘蔗葉片中SOD 和POD 含量迅速增加，ZD、TD 處理的SOD 含量顯著高于其他處理，復水后又逐漸減少，但還是顯著高于CK（圖3?A）。KD 處理POD 含量顯著高于其他處理，復水后含量又逐漸減少，且各處理干旱脅迫復水后POD 減少速度低于SOD 減少的速度（圖3?B）。

圖3 干旱和復水對各處理甘蔗苗期葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 3 Effects of drought and rehydration on the antioxidant oxidase activities of sugarcane leaves at seedling stage

2.4 干旱脅迫下接種內生菌對甘蔗苗期葉綠素的影響

干旱脅迫使得甘蔗植株葉片的葉綠素總含量顯著降低，而接種內生菌的各處理均不同程度地提高了甘蔗植株葉片中葉綠素總量和葉綠素a/b 的比例，其中ZD 處理的效果最佳，其葉綠素含量甚至高于CK 處理；而復水后各處理的葉綠素a/b 均出現上升的現象（表1）。

表1 干旱和復水對各處理甘蔗苗期葉綠素的影響Table 1 Effects of drought and rehydration on chlorophyll at seedling stage of sugarcane（mg·g-1）

2.5 主成分分析

首先對干旱脅迫下7 個處理的9 個生理指標進行相關性分析，可知有4 對指標呈顯著相關（P<0.05）；其中RWC 與MDA 呈顯著負相關，與SP呈顯著正相關；而RWL 與SP 呈顯著正相關，Pro與ChI 也呈顯著正相關，其中Pro 與Chl 的相關性系數最大R2=0.848（表2）。

表2 各指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis of each index

由指標間的相關性分析可知，各指標間存在不同程度的相關性，所以對干旱脅迫下7 個處理的9個指標進行主成分分析。將特征值≥1，且累積貢獻率大于80%作為判別條件，共提取到3 個主成分，將9 個抗旱性指標轉化為3 個獨立的綜合指標進行抗旱性綜合評價。其中，主成分1（PC1）的特征值為3.816，貢獻率為42.402%，主成分2（PC2）的特征值為2.658，貢獻率為29.533%，主成分3（PC3）的特征值為1.391，貢獻率為15.452%。前3 個主成分的累積貢獻率為87.388%，具有較好的代表性，與甘蔗苗期的抗旱性具有直接的關系，可作為7 個處理間抗旱能力評價的綜合指標。主成分1 中系數較大的有RWC（0.248）、SP（0.239）；主成分2 中系數較大的有Pro（0.293）和ChI（0.297）；主成分3 中系數較大的有SS（0.635）和ChI（0.302）（表3）。

表3 綜合指標系數及貢獻率Table 3 Comprehensive index coefficient and contribution rate

2.6 抗旱性綜合評價

采用隸屬函數法對各指標進行綜合性評價，根據1.2.3.1 中公式（1）計算各處理在3 個主成分中的隸屬函數值。綜合指標主成分1 中，YD 處理的隸屬函數值最大U1=1.000，WD 處理的最小U1=0.000；綜合指標主成分2 中，ZD 處理隸屬函數值U2=1.000最大，FD 處理的隸屬函數值最小U2=0.000；綜合指標主成分3 中，KD 處理隸屬函數值U3=1.000 最大，TD 處理的隸屬函數值最小U3=0.000。根據1.2.3.2的公式（2）計算各成分的權重，分別為0.485、0.338、0.177；最后根據1.2.3.3 的公式（3）計算干旱脅迫下7 個處理的抗旱性綜合評價值（D值），D值越大說明其抗旱性越強，7 個處理的抗旱性按照D值的大小進行排序為：ZD ＞DD ＞KD ＞TD ＞FD ＞YD ＞WD（表4）。

表4 處理的綜合指標值、權重、隸屬函數值（Ui）、D 值及綜合評價Table 4 Comprehensive index value, weight, membership function value（Ui）, D value and comprehensive evaluation of each processing

2.7 聚類分析

采用組間聯接法和歐氏距離對7 個干旱脅迫下的抗旱性綜合評價值D值進行系統聚類分析，在歐氏距離為5 處將7 個處理分為3 個類群。其中第1個類群包括：YD、FD、TD、KD、DD，對應抗旱性為中，第2 個類群為ZD，對應抗旱性為強，第3 個類群為WD 處，對應抗旱性為弱（圖4）。

圖4 聚類分析結果Fig. 4 Cluster analysis results

2.8 關聯性分析

利用1.2.4.1 的公式（4）將各變量的數據進行無量綱化處理（表5）?；疑P聯度分析是分析各指標與抗旱性之間的密切程度，根據1.2.4.2 的公式（5、6 和7）計算差序列、關聯系數和關聯度。通過灰色關聯度分析可知，各指標與抗旱性的關聯順序為SOD ＞ChI ＞RWC ＞Pro ＞SP ＞POD ＞RWL ＞MDA ＞SS。說明SOD、ChI、RWC、Pro 對各處理的抗旱性關聯度較大，是衡量干旱脅迫下7 個處理抗旱性的首要指標（表6）。

表5 數據的無量綱化處理Table 5 Non-dimensional processing of data

表6 干旱處理的抗旱性綜合評價值與各指標的關聯系數、關聯度和關聯序Table 6 Correlation coefficient, correlation degree and correlation order of the comprehensive evaluation values and each index of drought resistance under drought treatment

3 討論

苗期是對水分較為敏感且需水量較多的一個時期，植物苗期受水分脅迫較嚴重時可能導致植株死亡［20］。云南省多發生季節性干旱，直接危害甘蔗的萌發與幼苗生長，進而影響甘蔗的產量和品質，所以提高甘蔗苗期的抗旱具有重要的意義。植物在干旱脅迫下會在體內發生一系列的生理反應來保護自身免受損害。遇到干旱脅迫時，植物體內的Pro、SP、SS 等一些滲透物質的含量及抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性與植物的抗旱性呈正相關［21］。國內外學者已篩選出許多與甘蔗抗旱性有關的指標［18］，但甘蔗抗旱性鑒定指標的篩選目前尚未形成統一的評價標準［22］。本研究表明SOD、ChI、RWC、Pro 等指標與抗旱性綜合評價值D值的關聯度較高，是有效衡量各處理抗旱性強弱的首選指標。譚秦亮等［23］表明甘蔗葉片的抗氧化酶活性和滲透物質含量可作為甘蔗抗旱性鑒定和評價的重要指標，劉碩等［24］也表明葉綠素含量可以作為甘蔗抗旱性評價的重要指標，與本研究結果具有一致性。方自豪［18］研究表明甘蔗干物質重量和株高等生長參數及光合參數，可以作為甘蔗苗期抗旱性評價的有效指標，而抗氧化酶與滲透物質與甘蔗的抗旱性關聯較弱，與本研究結果具有一定的差異性。

許多研究均表明接種內生菌能提高植物的抗旱性［14,25-26］。本研究對不同甘蔗內生菌進行了組合接種，探究內生菌單一接種和組合接種對甘蔗抗旱能力的影響，試驗結果表明，接種內生菌能不同程度地提高‘ROC22’甘蔗苗期的抗旱性，但不是接種內生菌的數量和種類越多，其提高甘蔗抗旱性的效果越好。本研究結果顯示，3 株和4 株內生菌組合接種的處理（TD、FD）提高甘蔗抗旱性的效果反而沒有單一接種（ZD、DD 和KD）的效果好，但又比單一接種的YD 處理好。Zuo 等［9］也表明無論是單一接種還是組合接種，其提高植物抗旱性的效果主要取決于菌株的種類和不同組合，與本研究結果具有一致性。

本研究中接種ZM 內生菌的ZD 處理顯著提高了甘蔗苗期的抗旱性，且決定抗旱性有效的首選指標為SOD、ChI、RWC、Pro，說明ZM 菌株通過提高甘蔗苗期的Pro、RWC、ChI 的含量和SOD 酶活性來提高甘蔗苗期的抗旱性。Morales?Quintana等［11］發現接種內生真菌提高了草莓植株的光合效率、抗氧化酶活性和Pro 含量，并降低了MDA 含量。Scudeletti 等［13］也表明接種木霉菌的甘蔗植株，通過增加SOD、POD 活性以及Pro 濃度來緩解干旱脅迫對其生長的影響。Wu 等［27］發現在干旱下，內生菌接種顯著增加了植株葉片蔗糖、葡萄糖和果糖的濃度以及Pro 的含量，從而增強了三葉橙的抗旱性。此外，Wang 等［26］表明接種內生鏈霉菌屬，通過提高甘蔗ChI、Pro、植物激素含量及抗氧化酶活性等一系列變化改善了甘蔗植株的抗旱性，這與本研究結果具有一致性。本研究的結果可為后期內生菌提高甘蔗抗旱性的研究提供一定的科學依據。但因甘蔗植株在盆栽試驗與大田試驗的生長條件具有較大的差異，且外界氣候環境和土壤環境的復雜性及差異性，本研究的試驗效果還有待于進一步在大田試驗中進行驗證。

作物的抗旱性是受多因素影響和多基因控制的數量性狀，單一的指標不能代表其抗旱性的強弱，要綜合多指標才能準確客觀地對其抗旱性進行評價［18］。近年來，許多學者經常利用相關性分析法、主成分分析法、隸屬函數分析法、聚類分析法、灰色關聯度、干旱劃級法等分析方法對作物的抗旱性進行分析，且在多種作物中進行應用［22,28］。李小玉等［19］用主成和灰色關聯度分析對油菜耐旱性進行綜合評價，方自豪［18］也通過主成分分析法、加權隸屬函數分析法、聚類分析法和灰色關聯度分析相結合的方法對中蔗品種（系）進行抗旱性綜合性分析。本研究對干旱脅迫下7 個處理的9 個指標進行相關性分析，比較各指標間的相關性，并采用主成分分析的方法將9 個指標進行降維處理轉化為3 個綜合指標，隨后利用隸屬函數法得出抗旱性的綜合評價值D值，對干旱脅迫下7 個處理的抗旱性進行綜合評價。最后采用聚類分析的方法對各處理的抗旱能力進行分類，并利用灰色關聯度分析，明確了7 個處理中衡量其抗旱性的首選指標。本研究既考慮了綜合指標分析，消除了單一指標帶來的片面性，又考慮了單一指標的重要性，最后還明確了衡量抗旱性的首選指標，較單一指標和單一方法，提高了分析結果的準確性、可靠性和全面性。

4 結論

干旱脅迫下，與不接種內生菌的處理（WD）相比，接種內生菌能夠不同程度地緩解干旱脅迫，其中ZM 菌株單獨接種處理（ZD）的抗旱性綜合評價值D值最高，說明ZM 菌株接種處理緩解干旱脅迫的效果最佳。通過灰色關聯性分析表明，SOD、ChI、RWC、Pro 與各處理的抗旱性綜合評價值D值密切相關。因此，接種內生菌ZM 可以通過提高SOD 酶活性，增加ChI、RWC、Pro 的含量來緩解干旱脅迫，增強甘蔗苗期抗旱性。