石珊瑚共附生真菌次級代謝產物的抗炎活性及化學多樣性研究

廖清楠 周龍建，2，3 楊志友，2，3 馮昀鎧 黃誼君 胡雪瓊，3張翼，2，3 劉亞月，2，3

（1. 廣東海洋大學食品科技學院 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 廣東海洋大學深圳研究院海洋醫藥研發中心 湛江市腦健康海洋藥物與營養品重點實驗室，湛江 524088；2. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），湛江 524006；3. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心 大連工業大學，大連 116034）

炎癥是臨床常見的一個病理過程，是機體組織受到刺激或損傷后所產生的一種防御性應答反應，主要以紅、腫、熱、痛甚至組織器官功能喪失為癥狀［1-2］。炎癥是一把雙刃劍，適度的炎癥反應對人體是有益的；但過度、失控的炎癥反應則會導致組織的病變和二次損傷，是許多疾病的發病基礎?，F代藥理學研究表明，在系統性血管炎、腸道克羅恩病等一些自身免疫性疾病以及神經系統病變的疾病中，炎癥反應發生時，白細胞介素?1、白細胞介素?6、PGE2 等炎性相關因子的表達都有所上升，進而傷害到人體內部細胞，并對人體產生危害。目前，這些疾病正在全球范圍蔓延，并且已演變成嚴重危害人類健康和社會經濟可持續發展的重要公共衛生問題，越來越受到各國政府和社會的高度重視。因此，開發治療炎癥的有效藥物對多種疾病的治療具有重要的意義。

珊瑚，隸屬于腔腸動物門中的珊瑚蟲綱，是一種常見的海洋低等無脊椎動物。作為珊瑚礁生態系統的重要組成部分，廣泛分布于我國海南、西沙群島及南沙群島等熱帶海岸地區。珊瑚表面和組織內部聚集著豐富的微生物資源［3］，這些微生物與珊瑚宿主在長期的共同進化過程中，通過合成如抗菌、抗腫瘤、抗病毒和抗污損等［4-5］具有生物活性的次級代謝產物，共同抵御外敵入侵和病害防御，一直是藥物先導化合物的重要來源之一。從珊瑚共附生的真菌中分離的代謝產物化學結構多樣，涉及生物堿、聚酮、萜類、內酯類、環肽類、聚醚類、甾醇類、多糖類及不飽和脂肪酸等非甾體類化合物類型。目前，人們已經對多種珊瑚來源的共附生真菌進行了研究，并從中獲得了一系列具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗癌等多種生物活性物質。如李金鳳等［6］從乳白肉芝軟珊瑚（Sarcophyton glaucum）分離得到1 個新型西松烷型二萜，顯現出良好的抗炎活性。李旺盛等［7］對軟珊瑚Dendronephthyasp.的化學成分和抗炎活性進行研究發現，化合物11?acetoxy?3β,6α-dihydroxy?9, 11?seco?5α-cholest?7?en?9?one 對LPS 誘導的BV?2 細胞的炎癥反應具有抑制作用。Liu 等［8］在珊瑚真菌土曲霉中發現10 種丁烯內酯類化合物，活性結果表明，versicolactone B 對LPS 誘導的RAW 264.7 小鼠巨噬細胞中 NO 的產生有很強的抑制作用，比陽性對照吲哚美辛的作用更顯著，這表明它可能是一種潛在的新型抗炎藥的先導化合物。中山大學的Liu 等［9］從柳珊瑚真菌Penicillium sclerotiorum中分離得到4 種新的聚酮化合物，均能顯著抑制 LPS 誘導的巨噬細胞 RAW 264.7 中NO 的產生，且sclerketide B 和C，以及iso?chromophilone IX 在mRNA 水平上表現出下調iNOS和COX?2 表達。Shen 等［10］從軟珊瑚Lobophytum sarcophytoides中分離到2 種cembrane 型二萜類化合物，其中cembratriene?4,8,11?triol 能顯著抑制LPS 激活的RAW 264.7 細胞中NO 的產生。但是，現有活性先導化合物的研究只涉及珊瑚資源中的一小部分，且國內外對珊瑚共附生微生物的研究多集中在柳珊瑚或軟珊瑚等，對其他珊瑚科，尤其是石珊瑚及其共附生真菌來源的抗炎活性先導化合物的發掘及其作用機制的研究卻鮮有報道。

本研究中以徐聞石珊瑚來源共附生真菌為研究對象，探究不同培養條件對其次級代謝產物抗炎活性和化學多樣性的影響。分別選用PDB 和糙米培養基，并設置 3 種鹽度（0.3%、3% 和 10%），對 31株石珊瑚來源共附生真菌進行小規模發酵培養。以LPS 誘導的BV?2 小膠質細胞為炎癥模型，從中篩選出具有抗炎活性的菌株；并通過TLC 指紋圖譜、UPLC?QTOF?MS 以及FBMN 等技術手段進一步分析抗炎活性菌株次級代謝產物的化學多樣性，以期為后續深入挖掘石珊瑚共附生真菌中的抗炎活性次級代謝產物奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株和細胞 本實驗的31 株石珊瑚共附生真菌均采自廣東徐聞珊瑚礁自然保護區，目前保藏在廣東海洋大學海洋藥物研究所，菌株種屬及珊瑚來源如表1 所示；BV?2 小膠質細胞購于武漢大學中國典型培養物保藏中心。

表1 31 株珊瑚共附生真菌菌屬及珊瑚來源Table 1 31 coral symbiotic fungal genera and coral sources

1.1.2 培養基 PDB 培養基：配置好的馬鈴薯葡萄糖粉24.0 g，海鹽適量（鹽度為0.3%時添加量為3.0g，鹽度3.0%時添加量為30.0 g，鹽度10.0%時添加量為100.0 g），加水定容至1 L，pH =7.0，121℃滅菌30 min 備用。糙米培養基 ：糙米50.0 g，海鹽適量（鹽度為0.3%時添加量為3.0 g，鹽度3.0%時添加量為30.0 g，鹽度10.0%時添加量為100.0 g），加水定容至1 L，pH =7.0，121℃滅菌30 min 備用。完全培養基：向500 mL DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）高糖培養基中加入50 mL 過濾后的澳洲胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和5 mL 雙抗（青霉素-鏈霉素混合液100×）。

1.1.3 主要試劑與儀器 DMEM 高糖培養基，Gibco公司；胰蛋白酶?EDTA（0.25%），Gibco 公司；FBS，美國Zeta Life 公司；青霉素-鏈霉素混合液（100×），Gibco 公司；LPS，Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），Gibco 公司；NO 檢測試劑盒，碧云天公司；3?（4,5?二甲基?2?噻唑基）?2,5?二苯基溴化四唑（MTT），源葉生物。

多功能紫外透射儀，上海精科實業有限公司；霉菌培養箱及生物安全柜，上海博訊實業有限公司醫療器械廠；生物安全柜，上海博訊實業有限公司醫療器械廠；UPLC/Xevo G2?XS QTOF 超高效液相/串聯四極桿飛行時間質譜儀，沃特世科技（上海）有限公司；旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；超凈工作臺，上海博訊實業有限公司；CO2細胞培養箱，美國精騏有限公司；倒置顯微鏡，日本島津儀器有限公司；細胞計數儀，Countstar BioMed；Epoch2 酶標儀，購自美國BioTek 公司；離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；高效薄層層析板（GF254），購自青島凱邦公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將31 株石珊瑚來源共附生真菌凍存管置于溫度 28℃、濕度 80% 的霉菌培養箱活化過夜后，接種到已滅菌的海水馬鈴薯瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基的平板上，將平板置于霉菌培養箱中培養，待菌落孢子生長茂盛，接種到預先裝有200 mL 滅菌PDB 培養基的錐形培養瓶中培養 3-4 d，待菌落孢子生長茂盛備用。

1.2.2 OSMAC［11］策略下菌株的小規模培養 將平板長勢良好的31 株菌株在無菌條件下制備成種子液并分別接種到6 種不同培養基（鹽度0.3%、3%、10%的PDB 培養基，鹽度0.3%、3%、10%的糙米培養基），每組設3 個平行組，于室溫條件下靜置培養28 d。

1.2.3 菌株次級代謝產物的提取 將培養后的菌株分別用不同方法提取次級代謝產物，PDB 培養基的菌體和菌液分開，菌體用等體積甲醇進行超聲提取3 次，菌液用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，減壓濃縮得粗提物；糙米培養基用等體積甲醇浸泡，超聲提取30 min，重復3 次，甲醇提取液減壓濃縮得粗提物。

1.2.4 細胞培養及給藥 將凍存的BV?2 細胞迅速解凍后，將細胞凍存液轉移到離心管中并加入5 mL 完全培養基混合，1 000 r/min 離心5 min，棄去培養基，重新加入5 mL 完全培養基將貼壁的細胞吹打下來轉移到培養瓶繼續培養，備用。把處于對數生長期的細胞制成細胞懸液，將細胞以2×104個/孔的密度100 μL/孔的體積接種到96 孔板中，分為多組培養（control 組，LPS 組（1 μg/mL），試驗組（1、10、20、50、100 μg/mL），每組設5 個平行，放入培養箱培養24 h。

1.2.5 NO 測定 本實驗通過碧云天NO 試劑盒測定細胞中的NO 含量。其原理是：在有機酸條件下，對氨基苯磺酸和NO2-發生重氮化反應，然后再與鹽酸-萘胺偶合生成紫紅色物質，測定OD540nm值易知NO2-含量，進而推算出NO 含量。待測樣品所用溶液將1 mol/L 標準品稀釋為不同濃度（0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L），吸取30 μL 稀釋好的標準品于96 孔板中，加入磺胺溶液30 μL，室溫下避光反應5-10 min，再加入鹽酸-萘胺溶液30μL，繼續在室溫避光孵育5-10 min，用酶標儀檢測540 nm 處的吸光度。繪制標準曲線，得到回歸方程：y= 0.008 7x+ 0.049 3（R2= 0. 997）。細胞接種到96孔板分組培養24 h 后，分別吸取control 組、LPS 組和試驗組中培養基30 μL 于新的96 孔板，每孔加入30 μL 磺胺溶液反應5 min 后再加入30 μL 鹽酸-萘胺溶液繼續反應5 min，使用酶標儀檢測540 nm 處的吸光度。

1.2.6 細胞存活率 將細胞以5×103個/孔的密度和100 μL/孔的體積接種到96 孔板中培養，24h 后，加入待測樣品，使加入后樣品的終濃度分別為1、10、20、50、100 μg/mL；24 h 后，每孔加入10 μL 的MTT 溶液（用PBS 溶解成5 mg/mL），置于37℃、5% CO2的培養箱中繼續培養4 h，棄去培養基，每孔加入DMSO 溶液100 μL 溶解甲瓚，振蕩混勻后檢測波長540 nm 處的吸光度（λ）值，計算細胞存活率：細胞存活率（%）=樣品組OD540/空白組OD540×100%。

1.2.7 菌株次級代謝產物的TLC 分析 將上述粗提物用甲醇配置成10 mg/mL 的濃縮液，采用高效硅膠薄層層析板對各粗提物的化學多樣性進行分析。選擇乙酸乙酯∶正己烷=2∶1 二元溶劑體系作為TLC分析展開劑，并在波長254 和365 nm 下觀察代謝產物的分布情況。酚類化合物在自然界中廣泛存在，在治療炎癥方面也起到了良好的效果［12］，用鐵氰化鉀-三氯化鐵試劑進行顯色，對次級代謝產物中的酚類化合物進行追蹤分析［13］。

1.2.8 LC?MS/MS 分析 將各粗提物用色譜級甲醇配成等濃度樣品溶液進行液質分析。液相色譜條件：進樣量為1.0 μL，洗脫條件為：0.00-0.50 min，30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；0.50-4.00 min，30%-80%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；4.00-7.00min，80%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；7.00-7.20 min，80%-30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；7.20-8.50 min，30% 的乙腈水溶液（含0.1%甲酸），流速：0.3 mL/min。DAD 檢測器信號采集波長為190-600 nm，監測波長為 254 和 360 nm。色譜柱為：Waters ACQUITY UPLC BEH RP18（2.1 mm×50 mm,1.7 μm），質譜的質量掃描范圍設置為m/z50-2 000，電噴霧離子化，正離子模式。

1.2.9 FBMN［14］可視化分析 將原始液質數據文件的格式轉換為.abf 格式后，將其上傳至MS?DIAL 基于化合物的母離子精確質量和二級質譜的相似度與數據庫中的化合物進行匹配。然后通過MSFINDER Ver 3.52 將特征點列表里的化合物與不同的數據庫如PubChem、NPASS、COCONUT 和ChEBI 等進行比較，以注釋每個特征點可能代表的化合物。然后上傳至全球天然產物分子網絡集群數據庫（global natural products social molecular networking，GNPS）數據庫計算分析，將分析結果導入Cytoscape 軟件繪制分子網絡圖，利用FBMN 基于GNPS 的二級質譜相似度匹配功能可注釋樣品所含的已知化合物，并根據分子網絡圖中不同節點的關系，結合質譜數據，以推斷化合物種類及結構。

1.2.10 數據統計分析 采用GraphPad Prism 8 軟件，采用單因素方差分析（ANOVA）進行數據統計分析，P<0.05 被認為差異具有統計學意義，P<0.001 被認為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 菌株次級代謝產物的抗炎活性分析

小膠質細胞（BV?2）是中樞神經系統的固有免疫細胞，響應中樞神經系統疾病，特別是神經炎癥相關疾病的病理刺激。本文以LPS 誘導的BV?2 小膠質細胞為炎癥模型，對31 株石珊瑚來源共附生真菌次級代謝產物的抗炎活性進行篩選，結果如表2和表3 所示。PDB 培養基條件下，共有17 株菌株的次級代謝產物在不同濃度下顯示出一定的抗炎活性，其余14 株菌株均不顯示或者顯示弱（P≤ 0.05）的抗炎活性。且隨著鹽度的增加，具有抗炎活性菌株明顯增加。而糙米培養基條件下，27 株菌株的次級代謝產物呈現出顯著的抗炎活性，但隨著鹽度的增加，菌株抗炎活性無明顯差異。上述結果表明，不同培養條件對菌株抗炎活性的影響很大，如C1?5、C3?3、C3?8、C3?9 和C14?17 在PDB 培養條件下菌株次級代謝產物均不顯示抗炎活性，但在糙米培養基的3 個鹽度條件下均表現出良好的抗炎活性。同時上述5 株真菌的粗提物對NO 的抑制能力均表現出顯著的濃度依賴性，即隨著濃度的增大抑制NO產生的能力也隨之加強（圖1），尤其是菌株C3?9在低濃度條件下（10 和20 μg/mL）也表現出了顯著的NO 抑制活性。

圖1 糙米培養基條件下5 株共附生真菌粗提物對BV-2 細胞NO 產生的影響Fig. 1 Effects of crude extracts from five strains of symbiotic fungi on NO production in BV-2 cells under brown rice medium conditions

表2 PDB 培養基條件下各菌株粗提物的抗炎活性Table 2 Anti-inflammatory activities of crude extracts extracted from different strains under PDB medium conditions

表3 糙米培養基條件下各菌株粗提物的抗炎活性Table 3 Anti-inflammatory activity of crude extracts obtained from different strains under brown rice medium conditions

通過MTT 實驗檢測樣品對BV?2 小膠質細胞存活率的影響，進而確定實驗的樣品濃度水平。如圖2 所示，大部分實驗組細胞在用粗提物（濃度依次為1、10、20、50、100 μg/mL）處理24 h 后，其OD540nm值和空白組OD540nm值的比值約為100%，說明在這個濃度范圍里，粗提物對BV?2 小膠質細胞的存活率無顯著性影響。因此，在此濃度梯度下，大部分粗提物沒有細胞毒性，可用此濃度梯度繼續實驗。

圖2 糙米培養基條件下5 株共附生真菌粗提物對BV-2 細胞存活率的影響Fig. 2 Effect of crude extracts of five strains of symbiotic fungi on the viability and survival of BV-2 cells under brown rice medium conditions

2.2 菌株次級代謝產物的TLC圖像分析

2.2.1 5 株具有抗炎活性的菌株表觀形態對比 根據上述抗炎活性結果，選擇C1?5、C3?3、C3?8、C3?9 和C14?17 等5 株具有顯著抗炎活性的菌株作為目標菌株。通過對比菌株的表觀形態（圖3）和DNA 測序可知，5 株菌株分別屬旋孢腔菌屬Cochliobolussp.（C1?5），土曲霉A. terreus（C3?3 和C3?9），青霉屬P. citrinum（C3?8）和葡萄穗霉屬Stachybotryssp.（C14?17），其中3 株來源于牡丹珊瑚，1 株來源于普哥濱珊瑚，1 株來源于叢生盔形珊瑚。

圖3 5 株具有抗炎活性的菌株生長形態Fig. 3 Growth morphology of five strains with anti-inflammatory activity

2.2.2 5 株菌株次級代謝產物的TLC 圖像分析 利用 TLC 對上述5 株具有抗炎活性菌株的粗提物進行了不同波長下的紫外吸收、熒光斑點、三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色斑點的 TLC 指紋譜圖綜合比較，結果如圖4 所示，不同培養條件下各菌株次級代謝產物差異較大。相比其他菌株，C3?9 在波長 254 和 365nm 下吸收斑點明顯更多（圖4?C1、C2），這意味著其含有的次級代謝產物種類更為豐富。從圖4?C3 可看出菌株C3?9 在三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色劑作用下顯現出豐富的藍色斑點，這表明其具有豐富的酚類產物。進一步分析菌株C3?9 的TLC 圖像可知，PDB和糙米培養基下菌株代謝產物具有較大的差異。且隨著鹽度的增加，同一培養基下菌株的次級代謝產物也發生了一定的差異，部分次級代謝產物的斑點強度明顯降低，這表明鹽度的增加，會導致部分代謝產物的產量降低。

2.3 菌株C3?9次級代謝產物化學多樣性分析及FBMN可視化分析

為了進一步分析不同培養條件對菌株C3?9 代謝情況的影響，對6 個不同培養條件下的提取物進行了 LC?MS/MS 和FBMN 分析。從提取物的色譜基峰圖（圖5）可知，菌株C3?9 在PDB 和糙米培養基中的代謝產物具有一定的差異性，且與上述TLC 分析結果一致。PDB 培養基條件下，菌株次級代謝產物無明顯差異，但隨著鹽度的增加，部分產物的峰面積明顯減少，這表明其產量的降低，說明在PDB培養基中鹽度對次級代謝產物的產量影響較大。而糙米培養基中，0.3%和3%鹽度的條件下的粗提物的種類沒有表現出明顯的差異性。但是隨著鹽度的增加，10%鹽度下菌株的次級代謝產物豐富度明顯降低，且與3%鹽度的產物表現出了明顯的差異性，這與2.1 部分觀察到的3%鹽度產物抗炎活性顯著高于10%鹽度產物的現象具有很好的相關性。而MS?DIAL 特征離子表積分面積的對應峰在3%和10%兩種鹽度條件下的積分面積比進一步表明不同鹽度條件下的產物產量具有明顯的差異（表4），且在3%鹽度條件下產生的主要次級代謝產物的產量顯著高于10%鹽度條件下。從中選擇8 個質譜可檢測的產量發生顯著變化的主峰（峰1-8，差異性倍數>2），將其質譜數據提交到FBMN，并結合COCONUT、PubChem、LOTUS 等多數據庫做注釋分析（圖6），最終確定了這8 個主峰依次為cordycepin、visnagin、thymol、6?methoxyflavone、periplogenin、spathulenol、ectoine、gallocatechin。查閱文獻發現，這8 個化合物均具有抗炎活性。這對于3%鹽度產物明顯優于10%鹽度產物提供了合理的解釋。

圖5 不同培養條件下菌株C3-9 發酵產物的LC-MS/MS色譜基峰圖Fig. 5 LC-MS/MS base-peak chromatograms of the fermented products of strain C3-9 under different culture conditions

圖6 菌株C3-9 在0.3%和10%鹽度糙米培養基的代謝產物基于二級質譜聯系的分子網絡局部放大圖Fig. 6 Local magnification of metabolites of strain C3-9 in 0.3% and 10% salinity brown rice medium based on secondary mass spectrometric correlation of molecular network

表4 3% 和10% 鹽度下菌株C3-9 基峰色譜圖中產量具有差異主峰的數據庫挖掘及其峰面積的變化倍數Table 4 Database mining of strain C3-9 base peak chromatograms with differential primary peaks in yield at 3% and 10% salinity and the multiplicity of changes in their peak areas

3 討論

OSMAC 策略［15-17］，亦稱單菌株多次級代謝產物策略，是通過改變培養基營養成分、狀態，添加酶抑制劑，調控表觀遺傳，混合培養等方法，充分挖掘微生物合成次級代謝產物的能力，從而獲得更多類型的次級代謝產物。彭艾等［18］通過OSMAC策略從深海真菌Stachybotryssp.3A0009 中得到7 個單體化合物，其中包括3 個對人口腔上皮癌KB細胞有較強增殖抑制作用的化合物。Si 等［19］用OSMAC 策略從黃曲霉菌株中分離到8 個化合物，其中新化合物flavichalasines N 和O 及已知化合物aspochalasins I 和D 對3 種人癌細胞株有明顯的毒作用。通過OSMAC 策略，da Silva 等［20］從A. sydowii中激活沉默的代謝產物，得到具有較好AChE 抑制活性的5 個化合物：cyclo?（L?Leu?L?Pro）、cyclo?（L?Val?L?Pro）、cyclo?（L?Val?L?Leu）、cyclo?（L?Phe?L?Val）和ergosterol peroxide，且cyclo?（L?Val?L?Pro）的抑制活性最強。

本文采用OSMAC 策略，研究了不同培養條件和鹽度對31 株石珊瑚共附生真菌次級代謝產物抗炎活性和化學多樣性的影響?？寡谆钚越Y果表明，多數菌株粗提物在10%的PDB 和糙米培養基條件下顯示出了顯著的抗炎活性，且糙米培養基的粗提物的抗炎活性明顯大于PDB。化學多樣性分析結果表明，菌株在PDB 和糙米培養基條件下次級代謝產物具有一定的差異性。推測可能的原因是糙米培養基與PDB 培養基營養源的不同，使得產生的次級代謝產物有所區別。糙米培養基以淀粉作為碳源，而PDB 培養基則均以葡萄糖為碳源，碳源為菌體生長與代謝提供了物質基礎與能量，是培養基中重要的營養物質之一。碳源不同，菌株對碳源種類的利用程度不同，從而造成菌體產生的代謝產物種類和產量不同［21］。而在高鹽條件下表現出更好的抗炎活性推測可能的原因是高鹽條件下部分菌株細胞內編碼抗炎活性組分的沉默基因被激活了，從而導致更多的抗炎活性的代謝產物能夠被合成，使得粗提物的抗炎活性增加。

GNPS 是一個開放的串聯質譜數據的數據庫，能夠實現分子網絡的公共基礎平臺［22］，能快速對LC?MS/MS 生成的數據集進行分析［23-24］。馬小翔等［25］對一株高產丁內酯I 的海洋來源土曲霉C23?3進行化學調控，運用液相色譜-串聯質譜法以及基于質譜的分子網絡分析其次生代謝產物的產量和多樣性發現，菌株C23?3 經化學調控后的次生代謝產物產生了不同程度的變化。Wang 等［26］基于 MS/MS的分子網絡來研究A. caelatus的化學成分，從而發現了新的二酮哌嗪二聚體和曲霉素。Freire 等［27］通過GNPS 對海綿Agelas dispar的甲醇部分進行研究，從中發現了新的溴吡咯衍生物。

FBMN 是一種基于高分辨質譜的改進GNPS 方法［28］。在本研究中，利用FBMN 進行了活性菌株次生代謝產物的注釋，從數據庫中匹配到了8 個抗炎化合物［29-36］，且基于二級質譜相似性可發現多樣化的衍生物，從而獲得更多的抗炎活性物質。但從匹配結果可看出化合物的生物來源主要來自于植物和細菌，在珊瑚共附生真菌中尚未被發現，或尚未被GNPS 數據庫所收錄，說明珊瑚共附生真菌中的次級代謝產物值得進行深入研究。

4 結論

不同培養條件下石珊瑚共附生真菌次級代謝產物的抗炎活性和化學多樣性表現出明顯差異。其中5 株菌株在糙米培養基條件下表現出顯著的抗炎活性，而菌株C3?9 粗提物在低濃度條件下也表現出了顯著的抑制NO 產生的作用。進一步的TLC 和FBMN 分析顯示，菌株C3?9 的次級代謝產物中含有豐富的抗炎活性化合物，這為后續抗炎活性化合物的深入研究提供了基礎，對抗炎藥物的研發具有一定的科學意義。