芍藥苷轉化酶G6046 的異源表達及酶活鑒定

韓瀠儀 李章涵 曹學麗 裴海閏

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 北京工商大學輕工科學技術學院，北京 100048）

芍藥（Paeonia lactifloraPall）在中藥中被廣泛使用，歷史悠久，安全性好［1］。“逍遙丸”和“逍遙散”是典型的含有芍藥的中草藥制劑，是治療抑郁癥類疾病的處方藥［2-3］。芍藥的干根具有減輕疼痛、補血和調理月經的藥理活性［4］。芍藥苷是一種植物源水溶性單萜類糖苷，是芍藥的重要成分之一，對心腦血管系統尤其是在糖尿病相關的大血管并發癥方面有保護作用［5-6］。此外，研究表明，芍藥苷通過抑制小鼠海馬小膠質細胞，激活神經元FGF?2/FGFR1 信號，實現神經保護和抗抑郁作用［7］。因此，芍藥苷有可能是治療帕金森、阿爾茨海默病［8-10］、抗凋亡［11］、抗炎［12］、抗氧化［13］和抗抑郁活性［7,14-15］的重要候選藥物。

生物利用度低是許多具有藥理作用的天然化合物的共同限制［16］。芍藥苷主要從芍藥中提取，口服給藥后，直接吸收的很少，生物利用度較低［17］。芍藥苷靜脈給藥后主要以原型從腎臟排泄，離體肝灌流結果顯示它幾乎不能被代謝［18］。芍藥苷在血漿中的動力學參數也表明，它很少能在肺、肝和腸壁中轉化和吸收［19］。有研究表明，芍藥苷主要由腸道菌群代謝，其藥理作用可能通過芍藥苷代謝物產生［20］。然而，由于芍藥苷的生物利用度低和藥理機制未被揭示，導致其臨床適用性受到很大限制［18,21］。最近有研究顯示，腸道微生物酶的降解可能是芍藥苷生物利用度低的主要原因之一［14］。此外，關于芍藥苷及其他活性成分在大鼠胃腸道菌群中的吸收和轉化的研究表明，芍藥苷在大鼠盲腸和結腸中24 h 內被完全轉化［22］。這些結果證實了腸道菌群會代謝芍藥苷，并且芍藥苷可能對腸道微生物菌群同樣有調節作用，從而有助于緩解抑郁癥［14］。因此，研究芍藥苷的代謝產物及其腸道細菌的代謝作用對深入了解其藥理機制具有重要意義。

一些微生物酶具有相對的底物特異性。它們通常催化某一個特定的化學鍵類型或是具有立體結構特異性的反應。由于微生物代謝產物與哺乳動物代謝產物的相似性，微生物轉化已被用作研究某些藥物或天然產物在哺乳動物體內代謝的有效輔助方法［23-24］。有研究表明，微生物可以轉化芍藥苷，如短刺小克銀漢霉（Cunningham blakesleeana）（AS 3.970）［25-26］，但至今沒有詳細的機制報道。

本課題組前期通過蛋白質質譜和轉錄組學分析鑒定，在短刺小克銀漢霉中確定了一個芍藥苷轉化酶G6046（paeoniflorin converting enzyme, GenBank:OP856858.1），此酶可以將芍藥苷轉化為其他代謝產物，相關研究成果已發表［27］。使用軟件PSIPRED 4.0［28］和Phyre2［29］預測了G6046 的跨膜區、信號肽、二級結構及三級結構，分析預測模型結果發現，N 端第42-57 個氨基酸的區域為跨膜蛋白區。因此，前期研究還對基因N 端1-246 bp 堿基序列進行截斷，命名為G6046?NΔ82，再將目的基因G6046?NΔ82 和載體pET?22b 進行連接，成功構建了G6046?NΔ82?22b［27］。為了驗證此載體表達出的G6046 截斷是否具有芍藥苷的轉化活性，本研究在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達、純化了G6046 蛋白的NΔ82 截斷，并在體外對其酶活性進行了評估。結果證實G6046 蛋白確實可以將芍藥苷轉化為多種代謝產物，且經過純化及條件優化后，可以大大提高了芍藥苷的轉化效率。這可能為研究芍藥苷的微生物代謝提供了一條線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料 氨芐青霉素（Amp）、異丙基-β-D?硫代半乳糖苷（IPTG）、苯甲磺酰氟（PMSF）、5×蛋白上樣緩沖液和Tris：北京索萊寶科技有限公司；咪唑：賽默飛世爾科技有限公司；甘油、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和甲醇（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；NaCl、HCl 和NaOH（分析純）：中國醫藥集團有限公司；甲醇（色譜純），美國Fisher Scientific 公司；芍藥苷標準品：上海源曄生物科技有限公司；Ni?NTA 鎳柱：美國GE Healthcare 公司；Bradford：天根生化科技有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物：英國 OXOID 公司。

1.1.2 菌株與培養基 大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞：北京全式金生物技術有限公司；G6046?NΔ82?22b 重組質粒為本實驗室前期構建［27］。LB 液體培養基（g/L）：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5；LB 固體培養基（g/L）： 胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、瓊脂15；Amp 抗性液體LB 培養基（g/L）：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、100 mg/L Amp。Amp 抗性固體LB 培養基（g/L）：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、瓊脂15、100 mg/L Amp。

1.1.3 儀器與設備 電子分析天平：美國Denver 公司；高效液相色譜儀（HPLC）：Agilent 1260，美國Agilent 科技有限公司；恒溫金屬浴和恒溫磁力攪拌器：英國OXOID 公司；小型臺式離心機：北京索萊寶科技有限公司；高速冷凍離心機、恒溫振蕩培養箱和微量核酸蛋白檢測儀：Thermo Scientific 公司；高壓蒸汽滅菌鍋：日本松下公司；超凈工作臺：北京化工廠；超聲波細胞破碎儀：上海滬析實業有限公司；超速離心機：日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 重組載體G6046?NΔ82?22b 在大腸桿菌中的誘導表達 將已經構建成功的G6046?NΔ82?22b 重組質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，誘導表達G6046目的蛋白。首先將凍存的大腸桿菌感受態細胞BL21（DE3）（100 μL）在冰上融化5-10 min 后，加入重組質粒（1 μL），于冰上放置30 min。將混合液于42℃水浴中熱激60 s，隨后立即在冰上冷激2 min。向冷激后的混合液中加入LB 液體培養基900 μL 后，放置于37℃，150 r/min 振蕩培養45 min，離心2 min（1 000 ×g），棄上清（管內剩余大約100 μL LB 液體培養基）。振蕩混合均后將混合液均勻涂布在Amp抗性的LB 固體培養基上。37℃培養過夜后，挑取一個單克隆菌落，接種至100 mL LB 液體培養基（100 μg/mL Amp），37℃，180 r/min，培養12 h 作為種子液。向1 L 的LB 液體培養基中接種種子液30-50 mL，37℃，160 r/min 培養至OD600=0.8 時，加入IPTG 使終濃度為0.5 mmol/L 進行誘導表達。繼續在一定溫度（37℃、20℃、16℃）條件下分別培養4 h、12 h或者20 h，離心（4℃，8 000 r/min，15 min），棄上清，收集菌體并儲存于?40℃以備進一步使用。

1.2.2 芍藥苷轉化酶G6046 的提取 將5 g 菌體重懸于50 mL 裂解緩沖液（50 mmol/L Tris，pH 8.5，300 mmol/L NaCl，10%甘油），加入500 μL PMSF（0.01 mol/L）。將渦旋均勻的菌懸液置于冰上，超聲破碎45 min（超聲3 s，停9 s，功率120 W），超聲后的菌液于4℃，16 000 r/min 離心1 h。分別收集上清和沉淀，取少許沉淀于1.5 mL 離心管中，溶于30 μL裂解緩沖液（圖1?A 中P），4℃留存備用。取30 μL上清（圖1?A 中S），4℃留存備用。

1.2.3 芍藥苷轉化酶G6046 的純化 Ni?NTA 柱沖洗平衡后將上一步中收集的蛋白上清液于4℃層析柜中流經Ni?NTA 柱，收集30 μL 流出液（Ft），4℃留存備用。使用2 倍柱體積的裂解緩沖液沖洗Ni?NTA 柱，收集30 μL 流出液（W1），4℃留存備用。使用2 倍柱體積的20 mmol/L 咪唑溶液沖洗Ni?NTA柱，收集30 μL 流出液（W2），4℃留存備用。使用50 mL 濃度為200 mmol/L 咪唑溶液洗脫目的蛋白，收集洗脫液，取30 μL（E），4℃留存備用。蛋白純化完成后，使用3 倍柱體積的去離子水沖洗Ni?NTA柱，沖洗后將Ni?NTA 柱保存于20%乙醇中，存放于4℃層析實驗冷柜備用。用Bradford 法測定洗脫的G6046 蛋白的濃度，用SDS?PAGE 評估目標蛋白的純度。

1.2.4 芍藥苷轉化反應 將純化后的G6046 芍藥苷轉化酶轉入超濾管中，經高速冷凍離心機（3 000r/min，4℃）超濾濃縮，再加入裂解緩沖液繼續超濾，此步驟重復3 次以去除咪唑，最后濃縮至1 mL。使用微量核酸蛋白檢測儀檢測蛋白濃度，計算蛋白含量。用裂解緩沖液稀釋至原體積（相當于原濃度蛋白溶液），按酶∶芍藥苷=1∶1（mg/mg）的比例添加芍藥苷，即為芍藥苷反應液。置于室溫下反應，第0、24、48、72、96 小時分別取50 μL 反應液，按反應液∶甲醇 = 1∶6 的比例加入甲醇（色譜級），使酶失活。待蛋白沉淀后離心，盡可能完全去除沉淀，吸取上清液過0.22 μm 濾膜，進行HPLC 檢測。

1.2.5 生物轉化活性的HPLC 分析 向2 mL 離心管中加入1 mL 裂解緩沖液（pH 8.5），1 mg 芍藥苷，待溶解后加入濃度為1 mg/mL 的純G6046 蛋白溶液，每24 h 取反應液50 μL 檢測，連續監測反應96 h。使用Agilent ZORBAX SB?C18 色譜柱（150 mm×4.6mm, 5 μm）進行HPLC 分析以檢測芍藥苷和轉化產物的濃度。HPLC 流動相為甲醇（A）和0.2%磷酸水（B）（A∶B = 30∶70）；檢測波長為230 nm；流速為1 mL/min；洗脫時間為15 min；柱溫30℃；進樣量10 μL。G6046 比酶活被定義為在25℃條件下，每1 h 轉化1 μmol 芍藥苷所需酶量。

1.2.6 pH 的優化 調節裂解緩沖液至不同pH（7.0、8.0、9.0、10.0），取40 μL G6046 酶液（1 mg/mL），加入960 μL 不同pH 的裂解緩沖液，25℃下預保溫30 min 后分別加入1 mg 芍藥苷底物，經HPLC 檢測反應初始芍藥苷含量后立即放入25℃金屬浴中進行反應。于1 h、2 h、3 h 取樣50 μL，按反應液∶甲醇 = 1∶6 的比例加入甲醇（色譜級）。待蛋白沉淀后離心，去除沉淀，吸取上清液過濾膜（0.22 μm），通過HPLC 檢測芍藥苷反應量，檢測方法同1.2.5。

1.2.7 反應溫度的優化 優化反應pH 后，選取芍藥苷轉化酶G6046 反應最適pH，在經Ni?NTA 柱純化后的目的蛋白在超濾濃縮后使用最適pH 裂解緩沖液稀釋至原體積，取6 個離心管，分別加入1 mL酶液，保存于15℃、25℃、35℃、45℃、55℃和65℃金屬浴30 min 后每管中加入1 mg 芍藥苷，利用HPLC 檢測反應初始芍藥苷含量。檢測后立即保存在相應溫度的金屬浴中進行反應，每1 h 測定芍藥苷的含量。按反應液∶甲醇 = 1∶6 的比例加入甲醇（色譜級）。待蛋白沉淀后離心，去除沉淀，吸取上清液過濾膜（0.22 μm），通過HPLC 檢測第0、1、2、3、10、16、24 小時的芍藥苷反應量，檢測方法同1.2.5。

2 結果

2.1 重組大腸桿菌誘導表達條件的優化

由圖1?A 可知，G6046?NΔ82?22b 蛋白部分為包涵體形式存在于沉淀中，但也有部分蛋白在上清中表達。不同誘導條件下的蛋白含量結果如圖1?B，16℃，誘導24 h 產酶量最高，達到5.34 mg/g。因此在后續優化轉化反應實驗時均選用此條件誘導目的蛋白的表達。

2.2 不同反應條件對芍藥苷轉化酶G6046活性的影響

2.2.1 pH 對芍藥苷轉化酶G6046 活性的影響 在不同pH（7.0、8.0、9.0、10.0）條件下芍藥苷轉化酶G6046 的pH?酶活曲線如圖2 所示。在pH 9.0 時，第1 小時轉化量為0.246 mg（2.35%），到第3 小時芍藥苷轉化量為1.327 mg（12.67%），芍藥苷轉化率最高，如圖2 所示。由此可以計算得知，在25℃，pH 9.0 條件下G6046 比酶活為4.22 U/mg。因此，芍藥苷轉化酶G6046 反應最適pH 為9.0。

圖2 芍藥苷轉化酶G6046 的pH-酶活曲線Fig. 2 pH-enzyme activity curve of paeoniflorin converting enzyme G6046

2.2.2 溫度對芍藥苷轉化酶G6046 活性的影響 由于芍藥苷轉化酶G6046 反應最適pH 為9.0，因此選用pH 9.0 的裂解緩沖液為反應環境來優化反應溫度。扣除空白對照后得到不同溫度-酶反應速度曲線如圖3 所示，由結果可知，酶反應曲線在約3 h 內保持線性關系，隨著時間的延長，曲線趨于平緩，反應速率逐漸降低。

圖3 芍藥苷轉化酶G6046 在pH 9.0，不同溫度條件下酶反應曲線Fig. 3 Enzyme reaction curves of paeoniflorin converting enzyme G6046 at pH 9.0 and different temperatures

取前3 h 呈線性關系的部分繪制pH 9.0 條件下不同溫度G6046 反應模型（圖4?A）。由圖可知，在45℃條件下，前3 h 酶反應曲線斜率最高，酶活最強，酶反應線性關系為y=10.57x。取各溫度下前3 h 呈線性關系部分繪制溫度-酶活曲線圖（圖4?B）。由圖可知，在pH 為9.0，溫度為45℃時，芍藥苷轉化率最高，第1小時芍藥苷轉化量為1.107 mg（10.57%），第3 小時芍藥苷轉化量為3.320 mg（31.71%），由此可以計算得知，在45℃，pH 9.0 條件下G6046 比酶活為14.56 U/mg。因此，芍藥苷轉化酶G6046 反應最適pH 為9.0；最適溫度為45℃。后續實驗中G6046 轉化芍藥苷條件選用pH 9.0，溫度45℃。

圖4 G6046 在不同溫度下反應曲線Fig. 4 G6046 reaction curves at different temperatures

2.3 芍藥苷轉化反應結果

芍藥苷標準品液相色譜圖（圖5?A）中芍藥苷出峰時間為6.747 min；芍藥苷轉化酶G6046 與芍藥苷在原反應條件（pH 8.0；25℃；酶-芍藥苷 = 1∶10，mg/mg）下反應96 h 的液相色譜圖（圖5?B）中芍藥苷出峰時間為6.762 min。如圖5?B 結果顯示，芍藥苷的峰面積隨著反應時間的延長而逐漸降低，并隨之產生3 種新的物質，且這3 種新物質峰面積隨時間的延長而增加，出峰時間分別為2.963 min、4.247 min、10.684 min。由此可以說明G6046 可以將芍藥苷轉化為3 種新的物質，這3 種物質在后續的研究中已經得到了鑒定［27］。

圖5 芍藥苷和不同條件下芍藥苷轉化反應后的HPLC 色譜圖Fig. 5 HPLC analysis of paeoniflorin and paeoniflorin after conversion reaction under different conditions

前2.2.1 得出最佳反應pH 為9.0，在此pH 條件下，25℃，加入芍藥苷（酶-芍藥苷 = 1∶10，mg/mg）連續反應48 h，結果如圖5?C 所示。由圖可知，隨著反應時間的延長，芍藥苷的含量明顯的減少，3種反應產物隨之明顯增多。與芍藥苷標準品（圖5?A）對比發現，在反應48 h 后，反應液中的芍藥苷幾乎被反應完全。對比原反應條件（圖5?B），轉化反應速度得到了明顯的提高。

在2.2.2 中得到最適pH 和溫度條件下（pH 9.0；45℃），按酶-芍藥苷（1∶10，mg/mg）的比例加入芍藥苷進行反應。反應開始的0 h 與反應進行到28 h 時得到HPLC 結果如圖5?D 所示。與芍藥苷標準品（圖5?A）對比可以看出，芍藥苷的含量明顯的減少，3 種產物含量明顯增加。并且在反應28 h 后，反應液中的芍藥苷已經反應完全。對比原反應條件（圖5?B）和僅優化pH 的反應條件（圖5?C），轉化反應速度得到進一步提高。

在最適pH 和溫度條件下（pH 9.0；45℃）擴大酶與芍藥苷的比例，由最初的酶-芍藥苷（1∶10，mg/mg）擴大到酶-芍藥苷（1∶20，mg/mg），反應36 h，取50 μL 反應液處理后（處理方法同1.2.5）得到HPLC 色譜圖（圖6）。由圖6 可知，在反應36 h 后反應液中的芍藥苷已經反應完全，且仍可以生成同樣的3 種主要產物。證明在優化后的反應條件下，可以將G6046 與芍藥苷的比例擴大到1∶20（mg/mg），適當延長反應時間仍可以反應完全。因此本研究后續選用pH 9.0，45℃，G6046?芍藥苷（1∶20，mg/mg）進行反應，以期能夠獲得更多的反應產物，以進行下一步的產物純化及鑒定。反應體系逐步擴大如圖7 所示。

圖6 G6046 轉化芍藥苷36 h 后HPLC 檢測圖Fig. 6 HPLC analysis of 36 h conversion of paeoniflorin by G6046

圖7 G6046-芍藥苷反應體系逐步放大示意圖Fig. 7 Schematic of G6046-paeoniflorin reaction system by step-by-step amplification

3 討論

本研究在確定了短刺小克銀漢霉中一個芍藥苷轉化酶G6046 的基礎上，對該酶基因中選定的功能片段進行截取，再將目的基因G6046?NΔ82 和載體pET?22b 進行連接，成功構建了G6046?NΔ82?22b。為了進一步探究G6046 截斷是否具有芍藥苷的轉化活性以及對其酶活力的評估，必須選用合適的宿主來完成構建載體的表達和純化。

3.1 芍藥苷轉化酶G6046的表達純化

大腸桿菌E. coli因為其遺傳背景清楚、培養成本低、生長迅速等特點，成為如今最常用的外源重組蛋白表達的宿主［30-32］。而影響大腸桿菌表達系統產率的主要因素有表達載體的選擇和合適表達蛋白質的菌種的選擇。適用于蛋白質表達的載體種類繁多，應用最多的是pET 系列，能在大腸桿菌中高效且高產表達蛋白，在誘導表達幾小時后，目標蛋白產量可占總蛋白的50%以上。根據所使用表達載體的特點，目標基因密碼子的組成等因素選擇特定的表達宿主菌，而BL?21 菌種缺乏內生性蛋白酶ompT、ompP 和Lon protease，因此能防止產出的目標蛋白質被降解。本研究選用大腸桿菌作為宿主進行誘導表達，利用pET 系列的載體，可以將外源目的基因克隆到載體中，轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，可以獲得純度較高、具有一定產量的并且帶有6 個His 標簽的蛋白，便于后續的純化［33-34］。通過前期的研究發現，重組的芍藥苷轉化酶誘導后以包涵體的形式表達，因此進行了一系列的截斷設計［27］，發現G6046?NΔ82?22b 可以表達一部分蛋白在上清液中。為了提高誘導表達的效率，本研究在不同誘導條件（誘導溫度和誘導時間）下誘導目的蛋白折疊表達，結果可知，在溫度降低，時間延長后，每克菌體產酶量呈遞增趨勢，在16℃，誘導24 h 條件下產酶量最高，達到5.34 mg/g。這是因為較高溫度下，雖然細菌的生長速率較高，同時也會導致代謝產物積累，從而抑制細菌生長和目的蛋白的表達。此外，低溫條件下，雖然不利于大腸桿菌的生長，但是可以使蛋白的合成速率降低，在更溫和的條件下形成正確的折疊，促進蛋白的可溶性表達，更有利于蛋白溶解在上清中。因此選用16℃，誘導24 h 來誘導目的蛋白的表達。

3.2 芍藥苷轉化酶G6046的最適酶活條件

酶特異性催化化學反應的能力稱為該酶的酶活力，可以用在一定條件下，酶所催化其特異性化學反應的速度來表示。因此，通常用單位時間內底物的減少量或單一產物的增加量來表示酶反應速度。酶催化反應中，pH、溫度、離子強度、抑制劑、激活劑或酶本身的部分失活等都會對催化反應造成影響。本研究克隆表達的是芍藥苷轉化酶的截斷，在N 端截去了82 個氨基酸，因此首先考察截斷后表達出的酶是否具有活性，結果可知，芍藥苷的含量隨著反應時間的延長而逐漸降低，并伴隨3 種新產物的生成，且新生成產物的含量隨時間的延長而增加，由此可以說明構建的G6046 具有酶活性，可以將芍藥苷轉化為新的物質。在這些影響酶活的因素中，pH 和溫度是對催化反應影響較大的兩個因素［35-36］，因此在優化G6046 催化芍藥苷轉化反應中著重研究反應液pH 和溫度對催化反應速度的影響，主要從pH 和溫度兩個方面進行優化。在分別嘗試pH 7.0、8.0、9.0、10.0 后發現，G6046 在pH 9.0 的條件下酶活性最高，比酶活為4.22 U/mg。且優化pH 后，芍藥苷轉化反應可以在48 h 后基本反應完全，對比原條件（圖5?B，pH 8.0；25℃；96 h）可以看出，底物利用率得到了有效的提高，并且反應速度得到了明顯提升。優化反應液pH 后，進而優化了反應溫度。挑選出6 組不同溫度，相同pH（9.0）進行對比試驗，在15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃的不同條件下，45℃時反應最快，酶活性最高，比酶活為14.56 U/mg。對比原反應條件和優化pH 后的反應結果，優化pH 和溫度后，在28 h 后芍藥苷可以反應完全，酶反應速度得到了進一步提高。

當前，我國中草藥資源面臨日益緊缺的現狀，同時也面對藥材生物利用率低、浪費嚴重等問題。不僅限制了其臨床應用，更是影響著我國中藥產業的可持續發展。本課題通過研究短刺小克銀漢霉中可以轉化芍藥苷的G6046 蛋白，將G6046 相關基因克隆并進行外源蛋白的誘導表達、優化酶催化反應條件以及擴大酶反應體系等，證實了G6046 蛋白確實可以將芍藥苷轉化為多種代謝產物，大大提高了芍藥苷的轉化效率，可能會提高芍藥苷的生物利用率；反應體系的擴大也為進一步鑒定產物結構和構效關系研究提供了基礎。本研究可能為研究芍藥苷的微生物代謝提供了一條線索，為改善中草藥的生物利用度提供了新策略。

4 結論

本研究通過對重組載體G6046?NΔ82?22b 在大腸桿菌BL21（DE3）中的轉化和誘導表達實現了芍藥苷轉化酶G6046 的表達和純化。通過優化該轉化酶的酶促反應的條件，發現pH 9.0，45℃條件下，酶活性最高，比酶活為14.56 U/mg，且底物可以反應完全。通過擴大酶反應體系，將反應規模從G6046?底物（1∶1；mg/mg）擴大到G6046?底物（1∶20；mg/mg），使得轉化產物產量得到顯著提升，為分離芍藥苷轉化產物，進一步研究轉化產物結構及芍藥苷在體內的代謝機制奠定了基礎。