菠菜PSY 基因家族的鑒定與表達分析

任麗 喬舒婷 葛晨輝 魏梓桐 徐晨曦

（1. 上海師范大學生命科學學院，上海 200234；2. 上海師范大學植物種質資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200234）

類胡蘿卜素（carotenoids）是一類重要的天然色素的總稱，由所有光合生物（包括植物、細菌、藻類）和一些非光合細菌、真菌合成［1-2］，是天然產物中最大的家族之一，迄今已分類出850 多種不同的化合物［3］。植物中，類胡蘿卜素存在于各種類型的質體內，可使植物的花、果實或根部呈現(xiàn)出鮮艷的色彩［4］。在葉綠體富集的組織中，類胡蘿卜素可以作為光合作用的輔助色素，擴大光吸收范圍，并能通過能量淬滅和自由基排除來使植物細胞免受光氧化和熱應激的損傷［5-7］，對植物的生長和發(fā)育具有調節(jié)作用。此外，類胡蘿卜素還為植物重要激素脫落酸（ABA）和獨腳金內酯（SL）的生物合成提供前體［8-9］。對人體健康來說，類胡蘿卜素及其分解代謝產物是人類飲食中不可或缺的組成部分，可在人體內轉化為人體所必需的維生素A，有助于降低與衰老相關的疾病風險［10］。但是人類自身無法合成類胡蘿卜素，需要通過食物攝取和轉化來獲得［11］。常見的膳食類胡蘿卜素有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質、葉黃素、番茄紅素和玉米黃質等。菠菜和羽衣甘藍（Brassica oleraceaL. var.acephalaD.C.）等深綠色葉菜類蔬菜的葉黃素和玉米黃質含量最高，每克預制食品可含有75-150 μg［12］。

菠菜（Spinacia oleraceaL.）是莧科藜亞科菠菜屬一年生草本植物，是世界重要的綠葉菜類蔬菜作物之一，主要種植于中國、美國、土耳其和日本，其中中國產量占世界的91%。菠菜營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是綠葉菜中類胡蘿卜素含量最高的蔬菜［13］。不同菠菜種質資源間，類胡蘿卜素含量存在顯著差異［14］。

類胡蘿卜素幾乎在所有的質體中都是從頭合成的，在植物細胞的葉綠體和有色體中含量豐富［4］。植物中，類胡蘿卜素的酶促反應發(fā)生在質體膜上，并由核編碼酶介導［15］。該合成途徑首先是由異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）催化下縮合形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）［16］。GGPP 在八氫番茄紅素合酶（PSY）的催化下生成無色的15?順式八氫番茄紅素，這一步驟是類胡蘿卜素生物合成的主要限速步驟［17］。15?順式八氫番茄紅素進而在八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素異構酶（Z?ISO）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）和類胡蘿卜素異構酶（CRTISO）的連續(xù)修飾下形成全反式番茄紅素，接著全反式番茄紅素通過1 個或2 個環(huán)化酶催化為β-胡蘿卜素或α-胡蘿卜素［18］。隨后在羥化酶和環(huán)氧酶的羥基化和環(huán)氧化作用下產生葉黃素和玉米黃質［19］。而玉米黃質在玉米黃質環(huán)氧化酶（ZEP）催化下生成了紫黃質［20］。

PSY 是一類小家族基因，除了在部分藻類（綠藻和微胞藻）中存在PSY I 和PSY II 兩個家族外，其他藻類和高等植物中僅保留了PSY I 家族［21］。大多數(shù)植物中含有2-3 個旁系同源基因，但模式植物擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）［22］中只有1 個PSY基因，水稻（Oryza sativaL.）［23］、玉米（Zea maysL.）［24］、番茄（Solanum LycopersicumL.）［25］和小麥（Triticum aestivumL.）［26］中均含有3 個PSY 基因，而菠菜中共鑒定出4 個PSY 基因。盡管已經(jīng)對很多植物的PSY 基因進行了相關研究，但菠菜PSY 基因研究卻少有報道，本研究為后續(xù)對菠菜PSY 基因功能特性的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用菠菜‘KS4’‘US362’均為上海師范大學植物種質資源開發(fā)中心保存的自交系材料，其中‘KS4’為類胡蘿卜素高積累型栽培種材料，‘US362’為類胡蘿卜素低積累型野生種材料。菠菜種子經(jīng)過浸種1 d 后，播于72 孔育苗穴盤中，培養(yǎng)基質為草炭土與珍珠巖等比例混合。置于人工氣候室培養(yǎng)，光照9 h，黑暗15 h，溫度約為20℃，濕度約為70%。播種后30 d 將菠菜幼苗移栽入塑料花盆中，六葉一心期時進行不同處理。

1.2 方法

1.2.1 菠菜PSY 基因家族的鑒定 從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、 甜菜（Beta vulgaris） 和煙草（Nicotiana tabacum）基因組數(shù)據(jù)庫中獲得該物種類胡蘿卜素合成代謝相關基因的序列，在菠菜（Spinacia olerace）基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.spinachbase.org/）中進行全基因組 BLAST 分析得到菠菜類胡蘿卜素合成代謝相關蛋白的同源基因序列。結 合SMART（http://smart.embl heidelberg.de/） 和PROSITE（https://prosite.expasy.org/）的保守結構域基序分析，從菠菜基因組中鑒定獲得菠菜PSY 候選基因。利用ProtParam 在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）估算菠菜PSY 蛋白序列的分子量（Mw）、理論等電點（pI）、GRAVY 和不穩(wěn)定性指數(shù)。通過Wolfpsort 在線工具（https://wolfpsort.hgc.jp/）進行PSY 蛋白的亞細胞定位預測。

1.2.2 菠菜PSY 基因保守結構域、保守基序及基因結構分析 依據(jù)菠菜數(shù)據(jù)庫SpinachBase（http://www.spinachbase.org/）中的基因組序列和注釋信息，通過GSDS 2.0 在線網(wǎng)站（http://gsds.gao?lab. org/）對PSY 基因的內含子、外顯子及保守結構域進行可視化分析。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取擬南芥、甜菜、番茄和水稻PSY 基因的蛋白序列，并通過在線網(wǎng)絡服務器MEME（https://meme?suite.org/meme/tools/meme）識別PSY 蛋白中所包含的保守基序。

1.2.3 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 使用ClustalX v.1.83（默認參數(shù)）對菠菜、甜菜、擬南芥、番茄、水稻5 個物種PSY 蛋白序列進行多重序列比較，使用MEGA 7 將比對后的序列構建NJ 樹，步長檢驗值設為1 000，之后導出進化樹文件，利用TBtools 軟件進行繪制。

1.2.4 菠菜PSY 基因順式作用元件預測 利用TBtools 軟件從基因組數(shù)據(jù)中提取菠菜PSY 基因起始密碼子上游2 000 bp 的序列，并使用PlantCARE數(shù) 據(jù) 庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對得到的序列進行順式作用元件預測，預測結果通過TBtools 進行可視化。

1.2.5 菠菜總類胡蘿卜素含量測定 在菠菜六葉一心期時，連帶葉柄2 cm 處剪下其第二和第三對真葉，使用冷凍干燥機（?20℃，10 Pa）凍干處理，48 h 后取出樣品密封放置在?80℃冰箱中保存待測。將樣品加液氮磨至粉碎后取1.0 g 干樣粉末，加入10 mL丙酮沒過樣品，水浴超聲15 min；冷凍離心10 min，過濾收集上清液，反復提取至樣品無色；合并所有上清液，35℃旋轉蒸發(fā)；以1 mL 甲醇溶解，過0.22μm 濾膜，進行HPLC 檢測。每個樣品3 次重復，上述過程在暗環(huán)境中進行。

1.2.6 實時熒光定量PCR 分析和相關性分析 采取菠菜根、莖、葉、葉柄、薹葉、薹葉柄6 個組織部位的材料，使用TRIzol 法提取菠菜各個組織的RNA。利用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將提取的RNA 反轉錄成cDNA，于?20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肈BI?Bioscience BestarTMqPCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR 儀器上進行實時熒光定量PCR。定量引物通過NCBI網(wǎng)站設計后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。以菠菜18S為內參，以2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，使用Excel、GraphPad Prism 8.0 進行數(shù)據(jù)分析和作圖。將播種后30 d 的菠菜幼苗為供試材料，以白光為對照組，不同比例的紅藍光R1B3 和R3B1 為處理組，分別取處理24 h 和12d 的葉片提取RNA 并進行基因相對表達分析，方法同上。

表1 實時熒光定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

2 結果

2.1 菠菜PSY基因家族鑒定及理化性質分析

本研究從菠菜基因組中共鑒定出4 個編碼PSY蛋白保守結構域的基因, 其蛋白的理化性質分析結果如表2 所示，菠菜PSY 蛋白的氨基酸數(shù)在351-418 之間, 相對分子質量范圍為40-47 kD，理論等電點8.89-9.17。PSY 蛋白總平均疏水性為負值，屬親水性蛋白。通過對菠菜PSY 蛋白的亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)，4 個PSY 均定位于葉綠體。

表2 菠菜PSY 基因家族的鑒定及理化性質Table 2 Identification and characteristic features of PSY gene family in spinach

2.2 菠菜PSY基因結構及蛋白保守基序

菠菜PSY 基因家族不同成員的基因結構具有差異性（圖1）。利用GSDS 2.0 在線工具進行基因結構分析表明，除PSY3基因具有5 個外顯子外，其他3個基因具有6 個外顯子結構，外顯子長度介于50-426 bp；內含子長度變化與外顯子相似，介于79-514 bp。

圖1 菠菜PSY 基因結構分析Fig. 1 Gene structure analysis of PSY in spinach

SQS_PSY 是PSY 和角鯊烯合酶（squalene syn?thase, SQS）共有的保守結構域。由保守結構域分析可知（圖2），菠菜PSY 均含有SQS_PSY 保守結構域。保守基序結果顯示（圖2），菠菜PSY 家族成員至少具有6 個Motif 基序。SoPSY1 和SoPSY2 的保守基序一致，SoPSY4 的保守基序相比較于SoPSY1、SoPSY2 和SoPSY3，缺少了Motif 5。Motif1、2、3、4、5、6 組成了菠菜PSY 基因家族的典型保守區(qū)域，其中Motif 2 具有活性位點DXXXD（DELVD），并且該結構域在4 個PSY 蛋白中高度保守。

2.3 菠菜PSY基因家族系統(tǒng)進化分析

將鑒定到的4 個菠菜 PSY 蛋白序列，以及通過NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取的PSY 同源基因AtPSY（AAA32836）、OsPSY1（AAS18307）、OsPSY2（AK073290）、OsPSY3（DQ356431）、SlPSY1（ABM45873）、SlPSY2（ABU40771）、SlPSY3（XP_004228928.1）、BvPSY（XP_ 010675231.1） 和BvPSY（KMT13325.1）的蛋白序列，以鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，進一步探究菠菜和模式植物間PSY 蛋白的進化關系。結果（圖2）表明，水稻PSY2 和PSY3 的進化分支與其他雙子葉植物平行演化，但水稻PSY1 與雙子葉植物聚為一支；番茄PSY1 和PSY2 保守的聚為一支，菠菜PSY1 和PSY2 與同為莧科的甜菜聚為一支但二者遺傳距離更近；番茄PSY3、菠菜PSY3 和PSY4 形成相對獨立的進化分支。

2.4 啟動子順式作用元件預測

為分析菠菜PSY 基因的上游調控因子，提取4個SoPSY 基因起始密碼子上游2 000 bp 的基因組序列，并利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫進行順式作用元件查詢。結果（圖3）表明，菠菜PSY 基因含有多種環(huán)境和激素響應相關元件，其中參與光響應的順式調控元件和脫落酸響應元件最多。除SoPSY3僅含有5個光響應元件外，其余3 個PSY 基因啟動子序列均含有13-15 個光響應元件，如G?Box、Box 4、GT1?motif 和LAMP?element 等，表明該基因可能受光誘導表達或調控。此外，在PSY 基因啟動子序列中還鑒定出一些低溫脅迫調控元件LTR、與干旱脅迫相關的MBS 作用元件和厭氧誘導必需順式作用元件ARE，表明該基因參與的生理變化影響菠菜非生物脅迫的響應。

圖3 菠菜PSY 基因啟動子區(qū)域順式調節(jié)元件分析Fig. 3 Characterization of cis-acting regulatory elements in the promoter region of spinach PSY genes

2.5 菠菜PSY基因組織特異性分析

為進一步分析SoPSY 基因的生物學功能，利用RT?qPCR 檢測方法，在菠菜不同組織中檢測SoPSY基因的表達水平。結果（圖4）顯示，菠菜PSY 在地上部和地下部組織器官中表達水平具有顯著的差異，SoPSY4在根中高水平表達，顯著高于地上部分各組織器官；其余3 個PSY 基因在葉片中高水平表達，營養(yǎng)葉和薹葉中表達最高，其次是薹葉柄、短縮莖和葉柄，在根中表達量最低。此外，4 個基因中SoPSY2葉的相對表達量最高，約是其余基因葉的1.2-45 倍；SoPSY3薹葉的相對表達量最高，約是其余基因薹葉的1.7-57 倍。

2.6 菠菜PSY基因響應紅藍光比例變化的表達模式分析

基于PSY 啟動子中分布的大量光響應元件，為進一步分析PSY 基因可能的生物學功能，以白光為對照組，不同比例的LED 紅藍光R1B3 和R3B1 處理的菠菜幼苗葉片為供試材料，利用RT?qPCR 方法，檢測野生型材料‘US362’和栽培型材料‘KS4’中SoPSY 響應不同光質處理的表達水平變化。結果表明（圖5，圖6），不同基因型菠菜中，不同SoPSY 基因響應紅藍光比例變化的表達模式具有差異性。

圖5 紅藍光處理對‘US362’菠菜PSY 基因表達特性的影響Fig. 5 Effects of red and blue light treatment on the expression characteristics of PSY genes in ‘US362’ spinach

圖6 紅藍光處理對‘KS4’菠菜PSY 基因表達特性的影響Fig. 6 Effects of red and blue light treatment on the expression characteristics of PSY gene in ‘KS4’ spinach

在野生類型菠菜中（圖5），處理24 h 和12 d，SoPSY1和SoPSY2基因響應不同紅/藍光的表達模式一致，SoPSY3在24 h 處理下，受紅/藍光誘導表達顯著下調，但R3B1 和R1B3 處理組間表達水平無顯著差異；12 d 處理條件下，SoPSY3受R1B3 誘導表達顯著上調，R3B1 使其表達水平顯著低于白光對照組。SoPSY4在紅/藍光處理24 h 時與SoPSY3的表達模式相似，但各處理條件下SoPSY4的表達水平無顯著差異；與SoPSY3不同，處理12 d 時SoPSY4的表達水平受R3B1 誘導顯著上調表達，而R3B1 處理使其表達水平顯著低于對照組。

在栽培型菠菜‘KS4’中（圖6），紅藍光處理24 h 下，處理組SoPSY3和SoPSY4基因的表達水平均不同程度低于對照組，且R3B1 處理下的表達量低于R1B3 處理組；相反，SoPSY1和SoPSY2基因與對照組相比表達上調。處理12 d 時，4 個基因的表達呈現(xiàn)不同的響應模式，經(jīng)紅/藍光誘導后，SoPSY2和SoPSY3基因的表達量顯著升高且處理組間表達水平具有顯著差異；SoPSY4相比白光表達下調，而SoPSY1的表達水平與對照相比無明顯變化。上述結果表明，菠菜PSY 不同的表達模式可能與其基因啟動子區(qū)域中存在不同的光反應元件有關。

2.7 光質處理下菠菜類胡蘿卜素積累與PSY基因表達分析

為進一步探究菠菜PSY 基因表達量與類胡蘿卜素積累的關系，對不同比例的LED 紅藍光R1B3、R3B1 處理24 h 和12 d 的菠菜幼苗葉片分別進行總類胡蘿卜素含量的測定。結果（圖7）顯示。處理24 h 后，野生型與栽培型菠菜響應紅藍光比例變化的總類胡蘿卜素含量均顯著低于白光對照。不同之處在于，‘US362’受R1B3 誘導的總含量低于R3B1處理下的含量；而‘KS4’中相反，處理組R3B1 的總類胡蘿卜素含量顯著低于處理組R1B3 的含量。結果表明，24 h 短時間處理對‘US362’和‘KS4’總類胡蘿卜素的積累影響大，不同基因型材料的類胡蘿卜素積累對紅藍光比例的敏感性不同。紅/藍光處理12 d 后，KS4 菠菜對照組總類胡蘿卜素的含量為299.79 μg/g DW，分別是處理組R1B3、R3B1的2.21 倍和1.86 倍；在‘US362’中，R1B3、R3B1處理對其含量均未產生顯著性影響。結果表明，在12 d 長時間處理下，植物材料中光條件影響的類胡蘿卜素積累趨于穩(wěn)定，栽培型菠菜‘KS4’受光條件影響的類胡蘿卜素積累變化趨勢與野生類型菠菜‘US362’不同。

圖7 紅藍光處理下菠菜總類胡蘿卜素含量變化Fig. 7 Changes of total carotenoid content in spinach under red and blue light treatment

利用不同比例的LED 紅藍光R1B3、R3B1 處理后類胡蘿卜素含量的變化與4 個SoPSY 基因的相對表達水平作相關性分析（表3）。處理24 h 后，野生類型菠菜‘US362’的R1B3 處理組總類胡蘿卜含量的下降與SoPSY2和SoPSY3基因相對表達水平正相關，R3B1 處理組總類胡蘿卜含量的下降與SoPSY1基因相對表達水平呈顯著負相關，與SoPSY3正相關。處理12 d 后總類胡蘿卜素含量趨于穩(wěn)定，野生類型菠菜‘US362’中各試驗組間的總類胡蘿卜素含量差異不顯著，R1B3 處理組SoPSY2、SoPSY3和SoPSY4基因相對表達水平與含量變化正相關，其中SoPSY2呈顯著正相關，R3B1 處理組總類胡蘿卜含量變化與SoPSY1和SoPSY3基因相對表達水平負相關；栽培型菠菜‘KS4’中，R1B3 和R3B1 處理組的總類胡蘿卜素含量顯著低于白光對照組，R1B3 處理組SoPSY1和SoPSY2基因相對表達水平與含量變化呈正相關，R3B1 處理組含量變化與SoPSY1相對表達水平呈負相關。上述結果表明，SoPSY1、SoPSY2和SoPSY3基因的相對表達水平與處理組總類胡蘿卜素含量變化的相關性極強，這與它們均具有綠色組織表達特異性相一致。

表3 紅藍光處理下菠菜總類胡蘿卜素含量變化與PSY 基因相對表達量的相關性分析Table 3 Correlation analysis of total carotenoid content and PSY gene relative expression in spinach under red and blue light treatment

3 討論

3.1 菠菜PSY家族基因分析

本研究通過全基因組篩選在菠菜中鑒定了PSY家族基因，發(fā)現(xiàn)菠菜PSY 有4 個家族成員，水稻［23］、玉米［24］和番茄［25］中均含有3 個PSY 基因，模式植物擬南芥中僅有1 個PSY 基因［22］，表明植物界PSY 蛋白是一類保守且在不同物種間存在一定功能差異。通過對不同物種的PSY 家族的基因結構、功能域和進化樹等分析發(fā)現(xiàn)，菠菜的4 個PSY 蛋白均具有該家族蛋白高度保守的活性位點DXXXD，該位點是判別PSY 基因所編碼的蛋白是否具有酶活力的重要依據(jù)，在蘋果（Malus pumilaMill.）［27］、油菜（Brassica napusL.）［28］、辣椒（Capsicum annuumL.）［29］等物種的PSY 蛋白中也存在同樣的活性位點。進化分析上，菠菜SoPSY1 和 SoPSY2 與其他植物PSY 蛋白具有高度保守性，而SoPSY3 和 SoPSY4 形成獨立的進化分支，表明菠菜的4 個PSY 雖然都具有八氫番茄紅素合酶的保守結構但其功能可能不同。

3.2 菠菜PSY基因具有組織表達特異性

4 個PSY 基因的表達模式分析表明，SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3在葉片中高水平表達，而SoPSY4在根中的表達水平顯著高于其他組織，這一表達特征與水稻PSY 表達模式相似，OsPSY1和OsPSY2啟動子中存在大量光響應元件并在綠色組織中參與光合作用，而高鹽或干旱脅迫誘導OsPSY3在根系中表達［23］，故推測SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3可能在綠色組織中發(fā)揮功能參與光合作用等，SoPSY4可能具有不同的作用途徑和功能。

3.3 菠菜PSY1、PSY2和PSY3的表達水平與總類胡蘿卜素含量變化密切相關

不同組織表達特異性的PSY 催化類胡蘿卜素合成的能力不同，綠色組織特異性表達的PSY 的高表達水平對地上部分類胡蘿卜素積累具有主要貢獻［30］。本研究設置了R1B3 和R3B1 兩個光處理條件，栽培類型和野生類型菠菜中4 個SoPSYs 基因的響應模式不同，其中SoPSY1基因的表達在栽培型菠菜中不受給定光條件影響，SoPSY2基因的表達模式在兩種類型菠菜中相反，SoPSY3基因在兩種類型菠菜中的表達模式一致，而且它們的相對表達水平與總類胡蘿卜素含量變化密切相關。SoPSY1、SoPSY2和SoPSY3基因的表達在類胡蘿卜素低積累型的‘US362’中受R1B3 處理誘導，說明藍光更有效地提高其類胡蘿卜素生物合成基因的轉錄水平，但在導致更高代謝產物水平的轉錄后步驟中，可能存在其他影響因素。已有的報道中也觀察到藍光下生物合成基因的轉錄水平較高，如在單色光藍色LED 下，提高了白菜芽（Brassica campestrisL.）的PSY、PDS、βLCY、εLCY、CYP97A3、CYP97C1、βOHASE1、ZEP、VDE和CCD4基因的轉錄水平，而與白光相比，單色紅光降低了這些基因的表達水平［31］。這可能與紅光下，光敏色素互作因子PHYTOCHROME?INTERACTING FACTOR1（PIF1）抑制了PSY 基因的表達有關，在擬南芥［32］中也存在這種現(xiàn)象。

盡管影響菠菜類胡蘿卜素積累的核心調控因素和分子機制有待進一步研究，但本研究開展對菠菜八氫番茄紅素合成酶家族基因的生物信息學分析、表達特征及其與總類胡蘿卜素含量積累關系的探索，為菠菜PSY 基因的功能研究提供了新的視角，并且也為基于PSY 基因開發(fā)富含類胡蘿卜素菠菜的分子設計育種奠定了理論基礎。

4 結論

本研究在菠菜基因組中共鑒定到4 個PSY 基因，它們在進化過程中高度保守。SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3基因在綠色組織中表達水平顯著高于其他組織，SoPSY4具有根組織表達特異性。菠菜類胡蘿卜素含量在R1B3 和R3B1 處理后均下降；不同基因型菠菜中，各SoPSY 基因響應紅藍光比例變化的表達模式具有差異性，SoPSY1、SoPSY2和SoPSY3的相對表達水平與總類胡蘿卜素含量變化密切相關。